198184. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
5 HU 198184 B 6 tétjük. A reakcióelegyben a pH, a hőmérséklet és oxigénkoncentráció értékét folyamatosan mérjük és szabályozzuk (pH = 7,0, hőmérséklet = 35 °C, oxigénkoncentráció = 2 =5 mg/1). 5 óra és 20 perc múlva az oldott oxigén koncentrációja ugrásszerűen 7 mg/1 értékre emelkedik, ami a reakció befejeződését jelenti. A reakcióelegyet Amicon Hollow-Fiber HIMPOL-43 "szűrőn szűrjük. Az erősen jq koncentrált sejtszuszpenziót (50 x) a következő reakcióhoz félretesszük. A tiszta felső részt koncentrált sósavval pH = 1,5 értékre állítjuk és a kiváló hófehér 6-hidroxi-nikotinsavat leszívatjuk, a szűrön 15 vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk (20 mbar, 60 °C, 10 óra). így 122,3 g fehér terméket kapunk, amely HPLC-analízis szerint 99,2% 6-hidroxi-nikotinsavat tartalmaz. A felhasznált niko- 20 tinsavra vonatkoztatott kitermelés 95,4%. Az 1-3. példában kapott vegyületek NMR adatai megegyeznek a 6-hidroxi-nikotinsavra az Aldrich Library of NMR-Spectra, 2. kiadós, 2. kötet, 666D oldalon megadott adatok- 25 kai. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 30 1. Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására nikotinsav hidroxilezésével, azzal jellemezve, hogy a hidroxilezést Archromobacter xylosoxydans vagy Pseudomonas putida törzs jelenlétében 20-40 °C közötti hőmérsékleten 35 pH = 6-8 értéken 0,3-15 tömeg% nikotinsavat tartalmazó oldatban enzimatikusan végezzük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Archromobacter xylosoxydans DSM 2783 törzset 40 alkalmazunk. Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadósért felel: Himer Zoltán osztályvezető R-4858 - KJK 90.2147.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató túróval beoltjuk. A kultúrát 48 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten keltetőszekrényben rázzuk. A maximális sejtsűrűség elérése után a sejteket 20 percen keresztül 10 000 g értéken centrifugáljuk. A sejteket 10 ml foszfót-pufferban (50 mmól, pH = 7,0) felvesszük. (2. lépés) 1 literes rázólombikba 100 ml semleges 40 mmólos nátrium-nikotinát oldatot és 10 ml sejtszuszpenziót (1. lépés) töltünk. A reakcióelegyet 90 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten keltetőszekrényben intenzíven rázzuk. A sejteket lecentrifugáljuk, és a tiszta felső részt (108 ml) nikotinsavra és 6-hidroxi-nikotinsavra analizáljuk. HPLC-analízis szerint az oldat 361 mmól 6-hidroxi-nikotinsavat (Na-só) tartalmaz. A nikotinsavra számolt kitermelés 97,5%. A nikotinsav koncentrációja kisebb, mint a 6-hidroxi-nikotinsav koncentrációjának 0,2%-a. A szilárd 6-hidroxi-nikotinsav az oldatból erős savval végzett savanyítással izolálható. 3. példa Pseudomonas putida NCIB 8176 sejtek előállítása (1. lépés) A Pseudomonas sejteket az 1. példa 1. lépése szerint fermentáljuk. Ily módon 45,3 g nedves biomasszát kapunk. (2. lépés) 3 literes reakcióedénybe 1125 ml 10 tömeg%-os nátrium-nikotinát oldatot (pH = 7,0) töltünk és 35 °C hőmérsékletre melegítjük. Az NCIB 8176 biomassza 100 ml vízben felvett szuszpenzióját hozzáadjuk a reakcióelegyhez, és alapos kevertetéssel intenziven levegóz-5
