198184. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
1 HU 198184 B 2 A találmány tárgya eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására nikotinsav enzimatikus hidroxilezésével. A 6-hidroxi-nikotinsav szerves szintézis útján történő előállítására több eljárás ismert, például 2-piridonból kiindulva a hidroxiaromások Kolbe-Schmidt-féle karboxilezésével. Más eljárások almasavból vagy piridin-2,5-dikarbonsavból indulnak ki [lásd Brincourt et ab: J. Chim. Ther (1973), 8, (2) 226- -232, valamint a 7731/80 számú svájci szabadalmi bejelentést]. Az ismert eljárások azonban nem teszik lehetővé tiszta 6-hidroxi-nikotinsav egyszerű, olcsó és környezetkímélő előállitását. Az eljárások hátránya, hogy a reakció nem kvantitatív, és nemkívánatos melléktermékek kísérik. A melléktermékek szennyeződésként jelennek meg, és ezért a reakció befejeződése után el kell azokat távolítani. Ismert továbbá, hogy a Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Sarcina és Mycobakterium nemzettségbe tartozó mikroorganizmusok nikotinsavon fejlődnek, és ezt az anyagot szén-, nitrogén- és energiaforrásként alkalmazzák [Allinson M. J. C.: J. Bioi. Chem. (1943), 147, 785; Behrmann E. J.; Stanier R. V.: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923]. A nikotinsavat valamennyi vizsgált organizmus már az első lépésben 6-hidroxi-nikotinsavvé oxidálja. A 6-hidroxi-nikotinsavat rögtön és jelentős felhalmozás nélkül tovább alakítja. Ez a lebontás aerob organizmusoknál egészen viz, széndioxid és ammónia eléréséig lejátszódik. Csak a mikroorganizmusok feltárása után vált lehetővé, hogy a nikotinsav-hidroxilázt többé vagy kevésbé tiszta formában izolálják (Hunt A. L.: Biochem, J. (1958), 72, 1-7]. A nikotinsav-hidroxiláz mintegy 400 000 Dalton értékű nagy molekula. Ez a molekula flavinkofaktorokat, számos fématomot (Fe, Mo), szervetlen kénatomot és néhány esetben ázeleniumot is tartalmaz. A nikotinsav-hidroxiláz csak megfelelő elektronátadó rendszerek (például Cytochrome, Flavinok, NADP* és más hasonló rendszerek) jelenlétében aktiv. A nikotinsav-hidroxiláz sejtextraktumokból izolálható és az enzimpreparátum a nikotinsav hidroxilezéséhez felhasználható. Ezt az elvet követve sikerült kismennyiségű 6-hidroxi-nikotinsavat előállítani [Behermann és Stanier: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923]. Eltekintve az enzimválasztás magas költségeitől, és a nikotinsav-hidroxiláz bomlékonyságától, jelen esetben gondoskodni kell a kofaktorok és az elektronátadó rendszerek regenerálásáról is. A találmány feladata, hogy a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan eljárást dolgozunk ki, amely lehetővé teszi nagytisztaságú 6-hidroxi-nikotinsav gazdaságos előállítását nikotinsavból. A 6-hidroxi-nikotinsav előállítása során a találmány értelmében úgy járunk el, hogy a hidroxilezést Archromobacter xylosoxydans vagy Pseudomonas putida törzs jelenlétében 20-40 °C közötti hőmérsékleten pH = 6-8 értéken 0,3-15 tömeg% nikotinsavat tartalmazó oldatban enzimatikusan végezzük. Előnyösen alkalmazhatók az Achromobacter xylosoxydans DSM 2402, a Pseudomonas putida NC1B 10 521, amelyet Ensign és Riltenberg [J. Bioi. Chem. 239, 2285-2291 (1964)] ismertetett, ezen belül elsősorban az Achromobacter xylosoxydans DSM 2783. Különösen előnyösen alkalmazható az új Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 törzs, amely nikotinsav-anyalúgból izolálható. Morfológia és fiziológia: Tenyésztés: táptalajon (1) A sejt alakja: 2-3,5 /um hosszú és mintegy 0,6 pm széles pálcikák (2) Elrendeződés: egyesével (3) Motilitás: erősen mozgékony körkörösen ostoros (4) Endospórák: kizárólag aerob (5) Gram: negatív (6) Oxidáz: pozitív (7) Kataláz: pozitív. A törzs minden jellemzőjében azonos az Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 tipikus törzzsel (kivétel: az acetamid hidrolízise). A fenti törzseket a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (Mikroorganizmusok Németországi Gyűjteménye) Intézetnél (Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, NSZK) a DSM 2402 és DSM 2783 szám alatt vannak deponálva. Az új DSM 2783 számú törzs deponálásának napja: 1983. november 18. A Pseudomonas putida NCIB 10 521 és 3176 számú törzsek a National Collection of Industrial Bacteria Intézetnél (Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB98DC, Skócia) találhatók meg. A fenti törzsek egyedüli szén-, nitrogén- és energiaforrásként nikotinsavon fejlődnek. A mikroorganizmusok tenyésztését az ilyen típusú törzseknél szokásos eljárással végezzük. Például a DSM 2783 törzs hígított és sterilizált nikotinsavoldatban (0,05-0,5 tömegei) fermentálható, amely pH = 7,0 foszfát-puffert - 50 mmól - valamint nyomelemeket '20 ing/1 CaCl2'2H20, 10 mg/1 MnSOí, 5 mg/1 FeS04-7H20, 0,1 mg/1 CoCl2-6H20, 0,1 mg/1 CuS04-5H20, 0,1 mg/1 ZnS04-7H20, 0,1 mg/1 NaMo04'2H20), továbbá a fejlődés gyorsítása érdekében kis mennyiségű élesztókivonatot (Merck) (0,05 tömeg%) tartalmaz. A fermentációt 24-48 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten aerob körülmények között végezzük. A kapott biomassza (mintegy 10 g nedves tömeg literenként) riikotinsav-hidroxilázban gazdag. A sejteket lecentrifugáljuk, és azonnal vagy -20 °C hőmérsékleten történő táro5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
