198172. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás aminosav- és peptid-aril-amidok előállítására
1 198 172 2 A találmány tárgya javított eljárás az (I) általános képletű — álról P jelentése hidrogénatom, acil-csoport, 2—5 tagszámú peptidil- vagy adl-peptidil-csciport, amely előnyösen I,- vagy D-fenilalanint, L- prolint, L-alanint, L-glutaminsavat, L-glutamlnt vagy L-lizint tartalmaz, Xxx jelentése L-alfa-aminosav-csoport, előnyösen L-arginin, L-lizin-, L-valin- vagy L-glutnminsavcsoport, A jelentése p-nitro-anilino- vagy 4-metil-kumarin-7-il-amino-csoport, amely az Xxx L-alfaaminosav rész alfa- vagy omega-karboxilcsoportjához kapcsolódik — aminosav- és peptid-aril-amidok és savaddíciós sóik előállítására. Az (I) általános képletű aminosav- és peptid-arilamidok részben ismertek, részben újak és felhasználhatók mint kromogén, illetve fluorogén amid-szubsztrátok a proteolitikus enzimek és transzpeptidázok aktivitásának mérésére. Ezekből a vegyületekből ugyanis az enzimes hasítás során az enzim aktivitásával arányos mennyiségű A aril-amin szabadul fel, és ez a mennyiség egyszerűen meghatározható fotometriásan, illetve fluorometriásan. A fenti képletben az acil-csoport a kromogén, illetve fluorogén szubsztrátokban használatos acetií-, tozil-, benzoil-, benzil-oxi-karbonil-, terc-butil-oxikarbonil-, 3-karboxi-propionil-csoport, előnyösen az utóbbi három, az Xxx rész pedig olyan L-aminosavcsoport, mely a vizsgálandó enzim specificitásának megfelelő, tehát L-arginin, L-lizin-, L-hisztidin, L-alanin-, L-leucin-, L-izoleucin-,L-metionin-, L-norleucin-, L-valin-, L-norvalin-, L-fenilalanin-, L-tirozin-, L-triptofán-, L-prolin-, L-aszparaginsav-, L-aszparagin-, L- glutaminsav-, L-glutainin-, L-szerin vagy L-treonincsoport, előnyösen L-arginin-, L-valin-, L-lizin vagy L-glutaminsav-csoport. A kromogén és fluorogén amid-szubsztrátok szintézisében a kulcslépés P—Xxx acil-aminosav vagy acilpeptid és az A aril-amin közötti kapcsolat kialakítása. Az aril-aininok jól ismert kis bázicitása miatt ez a kondenzáció csak mérsékelt hozammal végezhető el, és elsősorban csak olyan módszerekkel, amelyek az aril-amin-komponens aktiválásán alapulnak. Például szolgálhat az első két kromogén amidszubsztrát, az L-lizin-p-nitro-anüid és a benzoil-DL- arginin-p-nitroanilid szintézise [B. F. Erlange és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 95, 271—279 (1961)]. Az L-izin-p-nitro-anilid szintézisénél a sav-komponenst aktiválták, az N^hf-biszíbenzil-oxi-karbonil)L-lizint és a p-nitro-anilint diciklohexil-karbodiimiddel (DCC) kondenzálták, a kapcsolás hozama 30% volt. Az arginin-származéknál a p-nitro-anilint aktiválták dietil-foszfitban oldott foszfor-jjentoxiddal, és ezt reagáltatták benzoil-L-argininnel. A nitranílid 74%-ban képződött racem formában (tehát az aktív anyagra számolt hozam 37%). A tozil-L-arginin-pnitro-anilid szintézise [E. Kasafirek és munkatársai: Collection Czehoslov. Chcm. Commun. 36, 4070— 4074 (1971)] már nem jár racemizációval, de a hozam csak 44% volt. A p-nitro-anilin aktiválásának másik módja az izocianáí-képzés. A p-nitro-fenil-izoclanát alkalmazhatóságát N Nishi és munkatársai vizsgálták [Bull. Chem. Soc. Japan, 43, 2900—2907 (1970): 46, 572—576 (1973)], és arra a következtetésre jutottak [Bull. Chem. Soc. Japan, 51, 1255-1256 (1978)], hegy az izocianat-módszer túlságosan bonyolult, sok kai előnyösebb a foszfor-pentoxidos aktiválás, illetve ennek általuk módosított változata. Ilyen módon a bcnzil-oxi-karbonil-L-arginin-p-nitro anilidct 50%-os hozammal állították elő. Az amino-csoport foszfor- # trikloriddal is aktiválható. Ilyenkor az amirio-komponenst és a foszfor-tiikioridot 1 :0,5 mólarányban reagáltatják vízmentes piridinben, vagy megfelelő mennyiségű plridint tartalmazó vízmentes közegben. Az amino-komponens és a foszfor-triklorid reakciója az ún, foszfazo-vegy öleihez vezet, ami savakkal savamidokat ad. Peptidek szintézise során [S. Goldschmidt és G. Rosculet: Bér. 93, 2387—2394 (I960)] a kapcsolások hozama 70—90%. Ezzel szemben a tozil-L-arginin-p-nitro-anilid előállításánál csak37%-ot sikerült elérni [E. Kasafirek és munkatársai: Collection Czechoslov. Chem. Commun. 36, 4070-4074 (1971)], és csak néhány egyéb, alkil-, illetve aralkiloldaiíáncú védett aminosav-p-nitro-anilid, pl. a benziloxi-karbonil -L - norvalin - p - nitro - anilid szintézisénél értek el nagyobb (65—73%) kitermelést [E. Kasafirek és munkatársai: Eur. J, Biochem. 69, 1-13 (1976)] A 7-amino-4-metil-kumarin acil-szürmazékainak a szintézisénél hasonló hozamokat találunk [M. Zimmerman és munkatársai: Anal. Biochem. 70, 258—262 (1976); 78, 47-51 (1977)]. DCC-kondenzáció esetén t-butíl-oxi-karbonil-L-fenilalaninnal még 44%-os hozamot kaptak, de benzoil-DL-argininnel már csak 3%-ot. Vegyes anhidriden keresztül haladó acllezésnél a t-butil-oxi-karbonil-L-fenilaianin-származék 55 %-kal képződött, de a t-butil-oxi-karbonil-L-arginin-származékot csak 13 %-kal sikerült izolálni. A benzil oxi-karbonil-L-arginin és a be:nzil-oxi-karbonil-NG-tozil-L- arginin DCC-kondenzációja 7-amino-4-metil-kumarinnai ugyancsak mérsékelt, 29%-os, illetve 37%-os hozammal járt (Jpn. Kokai Tokyo Koho 79 03,073 sz. japán szabadalmi leírás). Elsősorban tel) át az arginin-rész és az aril-amin közötti kapcsolat kialakítása jár mérsékelt hozammal, pedig az arginin-amid terminálisa szubsztrátok jelentősége különösen nagy, mert fontos enzimeknek, pl. a véralvadási és fibrinolitikus rendszer tripszinszerű enzimjeinek a meghatározására alkalmasak [pl. T. Morita és munkatársai: J. Biochem. 82, 1495- 1498 (1977); M. Zimmerman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 75, 750-753 (1978)]. A találmány célja olyan eljárás biztosítása, amellyel a kromogén, illetve fluorogén amid-szubsztrátként használt aminosav- és peptid-arilamidok az ismerteknél jobb hozammal állíthatók elő, továbbá új aminosav- és peptid-aril-amid szubsztrátok állíthatók elő. Azt találtuk, hogy a p nitro-anilin és a 7-amino-4- metil-kumarin jó hozammal kapcsolható alfa-nminocsoportján védett L-nrgimnhcz vagy más alkalmasan védett aminosavlioz, illetve pepiidhez piridinben íoszfor-trikloriddal, ha a foszfor-trikloridot a szoká-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
