198090. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L 17046 antibiotikum előállítására
5 198 090 6 C 56,74%, hidrogén 4,27%, nitrogén 7,99%, klór 5,11 %, hamu 0,6%; f) Rf értékek a következő TLC rendszerekben: eluáló rendszer (térf./térf.) Rf érték acetonitril/víz 75:25 0,53 (szilikagél, Merck 60 F2S4) acetonitril / 5 %-os vizes nátriumszulfát 0,54 30:70 (szilikagél, Merck szilanizált 60 F254) Előhívás: UV fény, 254 nin; 3%-os etanolos ninhidrin; 1 %-os metanolos fluoreszkamin; g) retenciós idő (tR) 10,8 perc; az elemzési inverz fázisú HPLC-vcl végezzük, 150X4,0 nim-cs ZorbaxR ODS (5—6 gin) oszloppal). A Zorbnx név a Dupont Co. védjegye egy oktadecilszilán szilika mátrixra); az eluálást 0—50 %-os lineáris grádienssel végezzük, 40 perc alatt, „B oldat az A oldatban” rendszerben: A oldat: 25 mM NaH2P04/acelonítnl 9:1, 0,1 N NaOH-dal pH 6,0—ra pufferolva, B oldat: 25 mM NaH2P04/acetonitril 3:7, 0,1 N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva, áramlási sebesség 2 ml/perc, belső standard 3,5-dihidroxi-toluol, tR 5,60 perc. h) az *H NMR spektrumot 270 MHz-en vettük fel DMSO-d6-ban 60 °C-on, 20 nig/inl minta koncentráció mellett (belső standard, TMS delta = 0,00 ppm). Néhány NMR adatot, amelyet D20 cserét és szelektív szétkapcsolást magukban foglaló kísérletek után kaptunk, a következőkben tüntetünk fel (delta ppm, multiplicitás): 1,86, s; 2,81, d; 3,5, dd; 3-4; 4,12, d; 4,32, d; 4,37, d; 4,56, s; 4,95, ddd; 5,07, s; 5,31, d; 5,39, s; 5,51, s; 5,66, d; 6,12, d; 6,29, s; 6,32, s; 6,37, s; 6,42, s; 6,60, d; 6,62, s; 6,64, d; 6,92, d; 7,09, s; 7,12, d; 7,21, d; 7,25, d; 7,43, d; 7,64, d; 7,66, d; 7,70, d; 7,85, s; 8,12, d; 8,46, d: 9,5, s. i) potcnciometrikus titrálási profil: a vizsgálandó vegyület oldatát — amely 0,01 N HC1 felesleget tartalmaz - ugyanabban az oldószer elegyben 0,01 N NaOH-dal titrálva 5,0 (egy egyenérték), 7,0 (egy egyenérték) pH 1/2 értékű titrálási görbe és a vizsgálandó vcgyülctct 9:1 dimetiformamid :víz oldatban 0,1 N KOIl-dal titrálva — amely ugyanabban az oldószer elegyben oldva 0,1 N HC1 felesleget tartalmaz - pH 1/2= 12,8 (öt egyenérték) értékű titrálási görbe; l) sóképzésre alkalmas sav-funkció; m) sóképzésre alkalmas bázis-funkció; n) N-acctil-D-glükózamin cukormaradék. A fizikokémiai adatok alapján, és más polipcptid antibiotikumokkal — pl. a vankomicinnel és a risztocetinnel — összehasonlítva közelítően az (I) általános képlet szerinti szerkezet tulajdonítható az L 17046 antibiotikumnak. Ha a nyerstermék, amelyet a rcakcióclegyből közvetlenül állítunk elő, bizonyos mennyiségű szennyezést tartalmaz — ezek a további hidrolízis és bomlás folytán keletkeznek -, amelyek a fent leírt eljárással nem távolíthatók el, oszlopkromatográfiás tisztítást alkalmazhatunk. Egy előnyben részesített kromatográfiás tisztítási módszer szerint a nyersterméket 9 :1 víz:acetonitril elegyben (térf./térf.) oldjuk - amelyet vizes ásványi sav hozzáadásával pH 1,9-re állítottunk be —, majd szilanizált szilikagél oszlopon kromatografáljuk, amelyet 1%-os vizes ammóniumfonniáttal stabilizáltunk. Szükség esetén az eluált frakciók pll-ját vizes ásványi sav vagy bázis hozzáadásával 5,9-re állítjuk be. Az L17046 antibiotikum sóképzésre alkalmas savas és bázikus funkciós csoportokkal rendelkezik, így gyógyászatilag elfogadható savakkal és bázisokkal egyaránt addíciós sókká alakítható, ismert eljárások segítségével. A savaddíciós sók a szakember számára ismert módon előnyösen ásványi savakkal képezhetők vagy erős savakkal, általában hidrogénhalogenid-, szulfur-, foszforsav, salétromsav, ecetsav, citromsav, aszparginsav, metánszulfonsav, toluolszulfonsav, szulfanilinsav alkalmazásával. A bázikus addíciós sók, például alkálifémekkel, alkáli földfémekkel képezett sók. Ammonium és szerves ammóniumsók, így alkil-ammónium sók ugyancsak ismert eljárásokkal képezhetők. Olykor ezek előnyösebbek, könnyű előállíthatóságuk és jő oldhatósági tulajdonságaik miatt. A bázikus addíciós sók a bázikus aminosav sókat, így például lizin, arginin vagy glicht sókat is magukban foglalják. Tekintettel arra, hogy az L17046 antibiotikum és sói igen hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, az L17046 antibiotikum biológiai tulajdonságaival kapcsolatban leírtak a gyógyászatilag elfogadható sókra is vonatkoznak. Az L17046 antibiotikum in vitro antibaklcriáiis aktivitása, mely főként Gram-pozitív baktériumokkal szemben mutatható ki, kétszeres hígítási módszerrel mikrotiter-rendszerben lett meghatározva. lososensitest táptalajt (Oxoid) és Todd-Hewitt táptalajt (Difco) használtunk Staphylococcus és Streptococcus törzseket vizsgálva. A táptalaj kultúrákat úgy hígítottuk, hogy a végső inokulum kb. 104 telepképző egységet tartalmazott ml-cnként (CFU/ml). A minimális gátló koncentrációt (MIC) a legalacsonyabb koncentrációként határoztuk meg, amely nem mutatott látható növekedést 18-24 órás. 37 ®C-on végzett inktibálás után. A kapott eredményeket az I. Táblázat mutatja. /. Táblázat Az L 17046 antibiotikum in vitro antibakteriális aktivitása Mikroorganizmus MIC (pg/ml) Staphylococcus aureus ATCC 6538 0,2 Staphylococcus aureus Tour 0,2 Staphylococcus aureus Tour (Isoscnsitcst broth + 30% bovine serum) 0.4 Staphylococcus epidei midis ATCC 12 228 0,05 Streptococcus pyogenes C 203 1,6 Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926 0,8 Streptococcus faccalis ATCC 7080 1,6 Streptococcus pneumoniae UC 41 1,6 t 10 1 íj 29 25 30 35 40 '5 r>o 55 30 35 4
