198089. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a gonadotropint felszabadító hormon antagonista dekapeptid származékok előállítására
11 198 089 12 I. Táblázat (folytatása) Peptid száma 1 R2 Rj r5 R(, r7 Rio K (c = 1, 50 7'-os ccclsavban) 17. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (50CH3)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-NH2-25,2° 18. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (5Br)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-NH2-21,8° 19. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (5F)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-NIlj-24,6° 20. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (5C1)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-NIIj-36,9° 21. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (5CH3)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-Nll2-20,9° 22. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (For)DTrp Tyr D-Arg Leu Gly-NIIj-28,5° 23. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (5F)-D-Trp Tyr (4-gua)-D-Phe Leu Gly-NH2-36.1" 24. béta-D-2NAL (4Br)-D-Phe (6N02)-D-Trp Tyr D-Arg Nie D-Ala-NH2-28.9° 25. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe (For)-D-Trp Tyr D-Arg Nva D-Ala-NH2-19.1° 26. béta-D-2NAL (4CI)-D-Phc (For)D-Trp Tyr D-Arg Leu D-Ala-NIL-21.8° 27. béta-D-2NAL (4C1)-L)-Phc (For)-D-Trp Tyr D-Arg Nie D-Ala-Nl I2-35,5° 28. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe (For)-D-Trp (2CH3)Phe D-Arg Leu D-Ala-NH2-21,8° 29. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe (For)-D-Trp Tyr D-Arg NMeLeu D-Ala-NH2-21,0° 30. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe (For)-D-Trp (2Cl)Phe D-Arg NMeLcu D-Ala-NH2-34,6° 31. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe D-Trp Tyr D-Arg 3PAL D-Ala-NII2-18,1° 32. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg D-3PAL Leu D-Ala-Nli2-29,8° 33. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg béta-D-2NAL Leu D-Ala-NH2-34,3° 34. dehidro-Pro (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg béta-D-2NAL 3PAL D-Ala-NIL-47,3° 35 dehidro-Pro (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg béta-D-2NAL Tyr D-Ala-NIL-50,6° 36. béta-D-2NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg D-Trp NMeLeu D-Ala-NH2-29,0° A találmány szerinti peptideket in vivo körűimé határozott : számú (6) felnőtt, nőstény. Spraguenyék között (az élő szervezetben) vizsgáljuk, de végezhetünk méréseket in vitro körülmények között (az élő szervezeten kívül) is. Az in vitro vizsgálatokat adott esetben patkány agyalapi mirigyből származó, disszociált sejtekkel végezzük. A sejteket a meghatározás elvégzése előtt 4 napon át sejttenyészetben tartjuk. A luteinizáló hormounak a peptidek alkalmazásának hatására kialakuló szintjét a patkány luteinizáló hormonjára nézve specifikus rádióim mun-assay módszerrel határozzuk meg. A kontrollként szolgáló sejttenyészetekhez csak 3 nanomól gonadotropin releasing hormont adunk; a mérésekhez használt scjttcnyészclckhcz viszont hozzáadunk 3 nanomól gonadotropin releasing hormont, plusz a jelenleg összehasonlító antagonistaként használt (Ac-dehydro-Pro1, (4-F)D-Phe2, D-Trp3;6/-GnRH-t (in vitro aktivitás —1) vagy a vizsgálni kívánt pepiidet, ez utóbbiak koncentrációja 0,01 nanomól és 10 nanomól között van. A csak gonadotropin releasing hormonnal kezelt minták által kiválasztott luteinizáló hormon mennyiségét összehasonlítjuk a pepiiddel plusz gonadotropin releasing hormonnal kezelt mintákban kiválasztott mennyiséggel. Meghatározzuk, milyen mértékben képes a vizsgált peptid a 3 nanomól gonadotropin releasing hormon állal felszabadított luteinizáló hormon mennyiségét csökkenteni, és ezt összehasonlítjuk a jelenleg összehasonlító anyagként használt peptid által kiváltott csökkentéssel. Az in vivo vizsgálatban azt határozzuk meg, milyen mértékben képesek a vizsgált peptidek nőstény patkányok ovulációját meggátolni. E vizsgálathoz meg-35 40 45 50 55 60 65 Dawley-törzsbeli, 225—250 g testsúlyű patkányt használunk. Az állatoknak a proösztrusz napján, körülbelül déli 12 órakor injekció formájában beadunk meghatározott (mikrogrammban kifejezett) mennyiségű, kukoricaolajban feloldott peptidet. A proösztrusz időszaka az ovulációt megelőző délután. Kontrollként egy másik, nőstény patkányokból álló csoportot használunk, ezeknek nem adunk be peptidet. A kontrollcsoport valamennyi nőstény patkánya a proösztrusz napjának estéjén ovulál; feljegyezzük, hogy a kezelt patkányok közül hány állat ovulál. Valamennyi vizsgált peptid igen alacsony dózisban szignifikáns módon meggátolja a nőstény patkányok ovulációját, és a körülbelül 5 pg-os dózisban minden vizsgált peptid teljesen hatásos. A fentinél kisebb dózisokkal további vizsgálatokat végzünk, az eredményeket az alábbi 2. táblázatban adjuk meg. II. táblázat Pepiid száma in vivo ,, , . . ovulációk dózis (ug) „ , szama in vitro aktivitás szórás (r) í. • 1 0/5 _ 0,5 4/14 — 2. 1 0/10 — 0,5 4/7 — 7
