198088. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leukémiás sejtek szaporodását gátló, immunstimuláló hatású peptidek, az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 198 088 2 A találmány tárgyát a leukémiás sejtek szaporodását gátló, immunstimuláló hatású, új (1) Gljf-Lys-NHí (2) Glp-Glu-Lys-Nífi (3) Arg-Lys-Glu-Nllj (4) Arg-Lys-Glu-OH (5) Arg-Lys-Gln-OH (6) Leu-Val-AIa-OH (7) Arg-Orn-Asp-Val-NHí (8) Arg-Orn-Asp-Val-ÜH (9) LysGlu-Lys-Lys-OlI (ió) Lys-Leu-Lys-Lys-OH (H) Lys-Asp-Leu-Lys-OH (12) Glu-Leu:Val-Ala-OH és (13) Leu-Pro-Ala-Gly-OH ptidek cs , savaddíciós sóik. valamint az ezekct hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás képezi. Ismeretes [Recent Progress in Honnone Research, 37, 369-412. (1981); Cancer Immunol. Imnvunothcr., 15, 78-83. (1983)], hogy egyes timuszhonnonok képesek a cilos/taükuminal vugy sugárzássá! kezelt betegek iimminfunkciójának helyreállítására, és egyes tumorsejtek fejlődésének gátlására. Ezt a hatást sikerült kiváltani kisebb hormon fragmensekkel is, amelyek terápiás alkalmazása előnyösebb, mint a nagy molekulatömcgű hormonoké vagy timusz kivonatoké; az eddig szintetizált kisebb peptidek immun- Itlmuláló Itatását több tesztrendszerben is sikerült egyértelműen kimutatni (lásd a 4 190 646,4 215 112, 4 395404 és 4 442 031 sz. amerikai egyesült államokbeli és 185 263 sz. magyar szabadalmi leírás, 2 938 420, 3 001 775 és 3 100 974 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat). A timopentint, a timopoictin 32-36 frugmensét, gyógyszerkészítmény hatóanyagaként már forgalomba is hozták. Ezek az ismert peptidek döntően Ï- és/vagy B-sejt proliferációt indukáló hatásúak, de közvetlenül nem gátolják a tumorsejtek proliferációját. Célul tűztük ki olyan új timopoietin fragmer.s analógok előállítását, amelyek az eddig ismert analógok immunstimuláló hatása mellett erős tumorgátló hatással is rendelkeznek. Meglepő módon azt találtuk, {rogy az (1)-(13) képletű új peptidek immustimuláló hatásuk mellett erős tumorgátló hatással is rendelkeznek. Az általunk használt teszt-rendszerben lumorgátló hatásuk erősebbnek bizonyult, mint a kontrollként használt, ismert immunstimuláló peptideké, így a timopentiné (4 190 646 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és a H-Arg-Lys-Asp-Val-OH képletű tetrapeptidá (135 263 sz. magyar szabadalmi leírás). A találmányunk szerinti peptidek abban is különböznek az ismert citosztatikumoktól, hogy csak a rákos sejtek szaporodását gátolják, és nem fejtenek ki általános (szisztémás) immnns/.upresszív hatást. Az (1) — (13) képletű peptideket és savaddíciós sóikat a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy amidált vagy hidrogenoíitikusan vagy acidolitikusan eltávolítható csoporttal észterezett karboxilcsoportot cs adott esetben védett oldalláncbeli aminoés/vagy hidrogenoíitikusan vagy acidoíitikusan eltávo- 2 lítható csoporttal észterezett karboxil-csoportot, és szabad a-amino-csoportot tartalmazó C-terminális amínosav-származékból kiindulva, aktív észtcrcs és/vagy vegyes anhidridcs kapcsolási cs a-amino-csoport fels/abadítási lépések egymást követő alkalmazásával az (I) — (13) képletű peptidek karboxil-csoporton észterezett vagy amidált, a pepíid-kötésben részt nem vevő amino-csoportokon védett származékait állítjuk elő. majd a jelenlevő védőcsoporlokut hidrogenolizissel és/vagy acidolízissel eltávolítjuk, cs kívánt esetben a kapott ( 1) — ( 13) képletű szabad peptideket savakkal reagáltatva savaddíciós sókká alakítjuk át. A szintézis során olyan védőcsoport kombinációt alkalmazunk, amely lehetővé teszi az amino-csoport védőcsoportjának szelektív eltávolítását, majd a szintézis végén az összes védőcsoport — lehetőleg egy lépésben történő lehasítását. A peptidkötés kialakítására a 168 431 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett pentafluor-fcnil-csztcres, vagy a 183 579 sz. magyar szabadalmi leírásban megadott vegye:'anhidridcs móds/.cri alkalmazzuk. Az amino-csoportok védésére a Doc- vagy a Z- csoportot, a karboxii-csoportuk védésére pedig a terc-butil-, a benzil- vagy a nitro-bcnzil-alkohollal végzett észterezést használjuk előnyösen. A fenti módon szintetizált védett pepiidről a szintézist követően eltávolítjuk az adott esetben rajta levő védőcsoporto;ka)t, majd a szabad pepiidet kívánt esetben savakkal kezelve savaddíciós sót képezünk. A védőcsoportok eltávolítására a katalitikus liidrogénezésí, vagy a savval végzett acidolízist használjuk. A kapott szabad peptidek általában gyógyászati felhasználásra alkalma: tisztaságnak, nem igényelnek további tisztitásí. Szükséges esetben azonban például szilikagé! tölteten oszlopkromatográfiával tisztíthatjuk. Az oldat formájában kapott pepiidet például az oldat bepárlásával, vagy liofilizáiásával nyerhetjük ki. A szabad pepiidet tetszőleges sóvá alakíthatjuk. A céivcgyúietek biológiai vizsgálatát az alábbi motion végezzük. 1. Tumorsejt proliferációt gátló hatás (in vitro) A kísérlethez K—562 emberi crürolcukcuiiá.s sejtvonalat használunk (stockholmi Knroliuska Intézel). A tenyésztést 10%-os fötális borjú savót tartalmazó RPMI-1640 jelű (Flow, Nagy-Britan ni a gyártmányú) táptalaj közegben végezzük 37 °C-on, 3% széndioxidot tartalmazó, párásított inkubátorban, műanyag edényekben. Egy-egy mérési pont 3—3 edényben mért adat átlagának felel meg. A kísérlet kezdetén a hígítás 0.5X105 sejt/ml volt. A kezelést 24 órává! a hígítás után végezzük oly módon, hogy a közeget a kezelés után nem változtatjuk meg. A hígítást követő 96 óráig 24 óránként Buerker-kamra segítségével megszámoljuk a sejteket. Az !. ábra a l.ys-Leu-Lys-l.ys pepiid tumorsejt proliferációt gátló hatását mutatja be. A bal oldali grafikonon az abszolút sejtszám értéket tüntetjük 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
