198057. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a biotin pentafluor-fenol-származékainak előállítására
1 2 (HOF*! ) és 0,(i50 g (3,1 mmól) dicikloliexil-karbodiimidt^ (IXT). A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 óra hosszáig keverjük, majd kiszűrjük a dicikiohcxil-karbamidot (DCU) és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A maradék olajat metanolból átkristályosítjuk. 0 A termek tömege: XOO mg(94,1%), op.: 182-186 C Rt. = 0,53 (10% MeOH/CHClj) = ♦ 33,18 (c =0,5 MeOH) 2. példa Biotinil-pentafluor-fenol-észter előállítása (biotin-OPFP) 1 g (4,1 mmól) biolint feloldunk 12 ml abszolút dimetil-formamidban. Oldási hőmérséklet 50 (>0 ( Hozzáadunk 1 g (5,4 mmól) pentufluor-fenolt, majd kis idő múlva 1,2 g (6 mmól) diciklohexil-karbodiimidet. Az oldatot szobahőmérsékleten kevertetjük, kb. 3 óra leforgása alatt a reakció teljessé válik. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot metanolból átkristályosítjuk. A termék tömege: 1,2 g (71,85%) op.: 187 -190°C '[a]2k:+33,2° (c =0,5, metanol) Rj-:0;53 (10% metanol :kloroform) 3. példa Biotinil-e-amino-kapronsav előállítása 0,1967 g (1,5 mmól) e-amino-kapronsavat feloldunk 1,5 ml IN NaOH-ban. 0 5 °C-ra hűtés után kevertetés közben hozzáadunk 0,585 g (1,4 mmól) biotin-OPFP-t 2,5 ml DMF-es oldatban. 1 órás 0 °C-on végzett keverés után pH = 2,0-re savanyítjuk a reakcióelegyet, majd a kívánt terméket kiszűrjük. A termék további átkristályosítást nem igényel. A termék tömege: 298 mg (83,670 OP-221 -222 °C Rf = 0,056 (10% MeOH/CHCl3) 4. példa Biotinil-e-amino-kapronsav előállítása 0,4 g (3,1 mmól) e-amino-kapronsavat 4 ml IN NaOH-oldatban feloldunk, és szobahőmérsékleten történő kevertetés közben 1,2 g (2,9 mmól) biotinil-pentafluorfenol-észter 5- 6 ml dimetilformamidos oldatát adjuk az előző oldathoz egy részletben. I órán keresztül folytatjuk a kevertetést, majd az elegyet feldolgozzuk. IN sósavval 2 pH-ra savanyítunk, a termék kristályosán kiválik, majd szárítjuk. A kapott termék tömege: 800 mg (80%), nem igényel további tisztítást, mert szennyezést nem tartalmaz. Op.: 215 - 219 °C R(: 0,056 (10% metanol -.kloroform) 5. példa Biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenol-észter előállítása 252 mg (0,706 mmól) biotinil-e-amino-kapronsavat melegítés közben 13 ml dimetil-formamidban oldunk fel. Szobahőmérsékleten 110 mg (0,63 mmól) HOPFP-t és 140 mg (0,69 mmól) DCC-t adunk az elegyhez, szobahőmérsékleten 2-3 órán át keverjük, majd a DMF-ot lepároljuk, a maradékot pedig metanolból átkristályosítjuk. Analitikai célra az átkristályosítást etilacetát-éterből végezzük. A termék tömege: 120 mg (80%) Op.: 161 164 T R|-: 0,24 (10% MeOH/CHClj) 6. példa Biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenolésztét előállítása 800 mg (2,23 mmól) biotinil-e-amino-kapronsavat 30 35 ml abszolút dimetil-formamidban oldunk fel 50 60 °C-on. Hozzáadunk 460 mg (2,5 mmól) pen- ■ tafluor-fenolt kevertetés közben, majd 570 mg (2,75 mmól) diciklohexil-karbodiimidet. A kevertetést kb. 3 órán keresztül folytatjuk szobahőmérsékleten. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot etllacetát petroléter elegyből kristályosítjuk. A termek tömege: 810 mg (67,8%) Op.. 161 164 C Rj-:0,24 (10 metanol .kloroform) A biotin-aktív-észterek felhasználásának jelentős területe a szerológia és az ummunhisztológía. Ezért szereológiai, illetve immunhisztológiaí vizsgálatokkal ellenőri/tűk, hogy a találmány szerint előállított, új aktív észterek megfelelnek-e az előzetes célkitűzésnek, azaz legalább egyenértékűek a korábban alkalmazott biotin-N-hidroxi-szukcinimid-származékokkal. S/.erológiui alkalmazás A szerológiában az Elisa (Enzyme-Unked-Immunosorbcn-Assay) egyszerű és érzékeny módszer az antitest, illetve antigén mennyiségi meghatározására. A meghatározás során úgy járunk el, hogy műanyag felületre kötött antigénhez biotinilált specifikus ellenanyagot kötünk, amihez acidin vagy strepatividín hídon keresztül biotinilált enzimet (tormagyökér peroxidáz, savanyú vagy alkalikus foszfatáz, béta-galaktozidáz) kapcsolunk. Az enzim a szubsztrátján keresztül színreakciót ad, aminek az intenzitását kolorimetriásan mérni tudjuk. Ha a műanyag felület telítve van az antigénnel, illetve a szabadon maradt specifikus kötőhelyek BSA-val le vannak fedve, akkor a biotinilált enzim csak a specifikus ellenanyaghoz képes kapcsolódni. Vizsgálataink során a következőképpen járunk el. A) Anti-cgér-|birka/ immunglobulin és tormagyökér-peroxidáz-enzim bíotinilálása Mindkét fehérjét 1 mg/ml koncentrációban 0,1 M NaHC03 (pH: 9,0) pufferben oldottuk. Az Immunglobulinhoz 1:3, az enzimhez 1 .-60 mól arányban dimetil-szulfoxidban oldott biotinil-e-aminokapronsav-pentafiuor-fenoí-észtert adunk. Szobahőmérsékleten 4 órát inkuháljuk, majd dialízissel eltávolítjuk az el nem reagált biotnil-e-aminokapronsav-pentafiuor-fenol-észtert továbbiakban biotin-eOPFP). A biotfnált enzimmel és streptavidinnel 1:2,4 mól arányban stabil komplexet hozunk létre, mely a továbbiakban más biotinilált fehérjék, például biotinilált anti-egér-jbirka/ 'lg előhívására alkalmazható. A fehérjék blotinilálásárá vonatkozó részletes adatok az azonos bejelentési napon tett szabadalmi bejelentésünk találhatók. B) Biotin-e-OPFP-ve! jelölt anti-egér-/birka/'!g,öszszehasonlítása a biotin-N-hidroxi-szukcinimid aktív észteréveltjelölt anti-egér-/birka/ ig-nal 98.05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
