198057. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a biotin pentafluor-fenol-származékainak előállítására
1 2 A találmány új blotin-származékok előállítási eljárására vonatkozik. A biotin - kémiai nevén hexahidro-2-oxo-I H-tieno[3,4-d|imidazol-4-penlánsav - a természetben általában proteinekhez kötődve előforduló anyag. Jellegzetes tulajdonsága, hogy az immunológiai reagenseket elterjedten alkalmazott avidinnel erős kölcsönhatásba lép. A biotin-avidin-kapcsolódáson alapuló kimutatás során az Immunológiai reakcióban résztvevő fehérjékhez, így elsődleges vagy másodlagos immunglobulinhoz, tormaperoxidázhoz vagy egyéb enzimekhez, illetve módosított nukleotid-trifoszfátokhoz biotint kell kapcsolni. Miután a jelölés során a fehérjék biológiai (immunfelismerő vagy enzim) aktivitása jelentésen nem csökkenhet, a kapcsolást enyhe fiziológiás körülmények között is hatásos eljárással kell végezni. A biotin fehérjékhez kapcsolására a 97.373 számú európai szabadalmi leírás' szerint a biotin-N-hidroxi-szukcinímid, ún. aktív észterének felhasználását javasolták. Ez az aktív észter vizes közegben, 8,0 pH-értéken jó hatásfokkal acilezi a fehérjék lizin maradékainak e-amino-csoportjait, illetve az arginineket. Az avidin-biotin-kötés tanulmányozása során kiderült, hogy az avidin biotin-kötő -helyei A mélyen helyezkednek el az avidin felszínétől, ezért a biotint célszerű egy távolságtartó farkon keresztül a fehérjéhez kapcsolni, ha a cél az, hogy a szabad biotinhoz hasonló erőséggel kötődjék. Erre a célra például az e-amino-kapronsav használható. (A biotinnak az e-amlno-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel képezett származékát az Enzo Biochem USA-beli) cég Enzotin márkanévvel forgalmazza). A biotin N-hidroxi-szukcinimid-észterének illetve az e-amino-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel képezett származékának előállítása eléggé bonyolult. Leírták ugyan ezeknek az észtereknek biotinból, dlciklohexil-karbodiimid (DCC) felhasználásával történő közvetlen előállítását is (K. Hofmann és munkatársai, Biochemistry, 21, 978-984 /1982/), a gyakorlatban azonban ez a reakció csak igen kis termeléssel szolgáltatja a kívánt reagenseket. Ezért gyakorlati célra az N-hidroxi-szukcinimid-származékok közvetett, kerülő úton való előállítását használják. A kiindulási vegyületből először N,N’-karbodiimidazollaI elkészítik a megfelelő imidazol-származékot, amelyből N-hidr- Qxi-szukcinimiddel, transzimidálási reakcióban keletkezik a kívánt N-hidroxI-szukcinimid aktív észter. A módszer alapvető hátránya a hosszú reakcióidő és a reagáltatáshoz szükséges magas hőmérséklet. A fenti problémák kiküszöbölése érdekében célunk olyan aktív-észterek előállítása volt, amelyek a fehérjék jelölésében legalább egyenértékűek az ismert biotln-aktív-észterekkel, de lényegesen egyszerűbben, jó hozammal, kíméletes reakciókörülmények között állíthatók elő. Azt találtuk, hogy a biotin pentafluor-fenil-származékai, amelyek új vegyületek az N-hidroxi-szukdnimid-származékoktól eltérően közvetlenül is jó hozammal előállíthatók. Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű biotln-pentafluor-fenol-származékok - a képletben n értéke 0 vagy 1 -előállítására, amelyre jellemző, hogy a (II) képletű biotint diciidohexll-karbodiimid jelenlétében pentafluor-fenollul reagáltatjuk, kívánt esetben a kapott (III) képletű biotin-pentafluor-fenol-észtert (biotin-oPF;P) e-amino-kapronsawal, a kapott (IV) képletű vegyületet pedig diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében pentafluor-fenollal visszük reakcióba. így kívánság szerint, vagy a biotinil-pentafluor-fenol-észtert (n = 0) vagy a távolságtartó (spacer) szakaszt is tartalmazó biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenol-észtert állítjuk elő (n = 1). Mind a (III) képletű biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenol-észtert alkalmas aminosavak, peptidek, fehérjék enyhe körülmények közötti biotinilezésére. A gyakorlatban az N-hidroxi-szukcinlmid-származékokkal kapcsolatban említett okokból, a (IV) képletű vegyület felhasználása előnyösebb. A találmány szerinti eljárás első lépésében, azaz a (III) képletű biotinil-pentafluor-fenol-észter előállítása során úgy járunk el, hogy a biotint egy inert szerves oldószerrel, például dimetil-szulfoxiddal vagy dimetil-formamiddal, előnyösen dlmetil-formamiddal készült oldatban, DCC jelenlétében reagáltatjuk a pentafluor-fenollal. A reakcióhőmérséklet általában 20 és 50 °C között változtatható, de legelőnyösebben szobahőmérsékleten hajtható végre a reakció. A pentafluor-fenolt a biotinre számítva előnyösen sztöchiometriás arányban alkalmazzuk. Az eljárási lépés egy előnyös megvalósítási módja szerint a biotint dimetil-formamidos oldatban pentafluor-fenollal és DCC-vel szobahőmérsékleten 1-2 órán át keverjük. A vegyületet a diciklohexil-karbamid (DCU) kiszűrése után ismert módszerekkel, például a szűrlet vákuumban végzett bepárlásával elkülöníthetjük, és szükség esetén szokásos eljárásokkal, például átkristályosítással tisztíthatjuk. A biotinil-pentafluor-fenol-észter gyakorlatilag kvantitativen keletkezik. A kapott blotinil-pentafluor-fenol-észter az előző lépéssel kapcsolatban felsorolt inert szerves oldószerekkel, előnyösen dimetil-formamiddal készült oldatban, vizes-alkálikus közegben reagál az a-amino-kapronsawal. A reakcióhőmérséklet általában 10 és 30 °C között változhat, előnyösen azonban szobahőmérsékleten dolgozunk. Az e-amino-kapronsavat a biotin-pentafluor-fenol-észterre számítva általában sztöchiometriás mennyiségben alkalmazzuk. 0—5 °C hőmérsékleten a reakció mintegy egy óra alatt lejátszódik. A reakcióelegy savanyítása (pH 2,0-ig) hatására a biotin-amid-származék fehér kristályok formájában kiválik. Ebben a lépésben a hozam 85—90%, és a termék közvetlenül, további tisztítás nélkül továbbalakítható. A biotin-amid-származék és a pentafluor-fenol reagáltatása során a reakciókörülmények lényegében megegyeznek az eljárás első lépésével kapcsolatban leírtakkal A kapott biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenolészter kívánt esetben ismert módszerekkel, például átkristályosítással tisztítható. Az utolsó lépés 80-85%-os hozammal valósítható meg. A találmány szerinti eljárás részleteit a következő kiviteli példákban Ismertetjük. 1. példa Biotinil-pentafluor-fenol-észter előállítása 0,506 g (2,07 mmól) biotint feloldunk 6 ml abszolút dimetil-formamidban (DMF), majd hozzáadunk 0,504 g (2,78 mmól) pentafluor-fenolt 198.05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
