198037. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 6-(4-htt-1-piperazinil)-5,8-kinolindion-származékok és az ezeket tartalmazó agyógyszászati készítmények előállítására
1 2 dékot a pipettával óvatosan felszívjuk és kiengedjük, míg a sejtekből homogén szuszpenziót képezünk. Ezután a kémcsőbe közel 45 ml térfogat beállítása hoz elegendő mennyiségű tris-A puffert adunk, majd a kémcsövet 4 °C-on 8 percen át I IO x G sebességgel centrifugáljuk, A felülűszót leöntjük, majd a visszamaradt sejteket az előbb említett módon újraszuszpendáljuk és ismételt centrifugálásnak vetjük alá. A felülűszót ezután leöntjük, majd a visszamaradt sejteket 2-3 ml tris-ACM pufferben szuszpendáljuk, hogy a végtérfogat elegendő legyen a reakcióedényekbe való adagoláshoz. Anti-IgE-t vagy antigéneket - önmagukban vagy a kísérleti vegyülettel együtt - 0,2 ml össztérfogatban tartalmazó reakcióedényeket készítünk elő és helyezünk el 37 °€ hőmérsékletű fürdőben. A sejteket 37 °C-ra melegítjük és gyakran keverjük egyenletes szuszpenzió biztosítása céljából, miközben mindegyik reakcióedénybe 1,0 ml-es alkuitokat adagolunk A reakcióedényeket ezután 37 C-on 60 percen át inkubáljuk, 15 percenként gyenge keverést végezve abból a célból, hogy a sejetek egyenletesen szuszpendálva maradjanak. A reakció befejeződése után a reakcióedényeket 4 °C-on 1500 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugáljuk a sejtek ülepítése céljából. A felülűszóból 1 ml-es aliquotokat bemérünk 1 2 mm.75 mm méretű polietilénből készült kémcsövekbe, majd mindegyik kémcsőbe 0,2 ml 8%-os perklórsavat adagolunk. Mindegyik kísérletbe vakmintát és úgynevezett totálmintát veszünk fel. A vakminta tartalmazza a sejteket és az összes reagenst, kivéve az aintigént vagy az anti-IgE-t. A totálminta 0,24 ml 8%-os perklórsavat, 1 ml sejtet és 0,2 ml puffert tartalmaz. Mindegyik mintát ezután centrifugáljuk a kicsapódott fehérje eltávolítása céljából. A felszabadult hjsztamin kimutatása automatizált fluorometriás módszerrel Ezt az automatizált módszert Siraganian, R.P. ismerteti az Anal. Biochem., 57. 383 (1974) és J. Immunol. Methods, 7. 283 (1975) szakirodalmi helyeken. A módszer a Shore, PA. és munkatársai által a J. Pharmacol. Exp. Ther., 217. 182(1959) szakirodalmi helyen ismertetett manuális módszeren alapul. Az automatizált rendszer a következő, Technicon Autoanalyzer II rendszerbe tartozó komponensekből áll: 7-60 jelzésű, szűk átfolyású primer szűrővel és 3-74 jelzésű szekunder szűrővel ellátott fluorofelométer, IV mintavevő, III kétsebességes adagolószivattyú, adatrögzítő és digitális nyomtató. Az alkalmazott kísérleti módszer lényegében azonos a Siraganian által a fent említett publikációban ismertetettel, a következő módosítások mellett: a dializálót elhagytuk, a szivattyúzáshoz használt összes vezeték egyetlen nagy kapacitású elosztó szivattyún halad át és kétszeres térfogatú mintát veszünk az elemzéshez. Az automatizált kémiai elemzés a következő lépésekből áll: bázikus kémhatású sóoldat extrahálása butanollal, a butanolos extraktum visszaextrahálása hig sósavoídattal heptán adagolása mellett, a hisztamjn reagáltatása orto-ftáldialdehjddel (OPT) magas pH-értéken és az OPT-addukt átalakítása stabil fluoroforrá foszforsavval. A reakcióterméket ezután a fluorométeren vezetjük át. A teljes skálájú választ 50 ng hisztaminra állítjuk be, a hat árérzékenységet megközelítőleg 0,5 ng-nak véve. A hisztaminkiválasztási kísérletek eredményeinek kiszámítása Mindegyik mintánál a ng-ban mért hisztaminból levonjuk a míiszer-vakmintánál (mosófolyadék) kapott értéket. Ezután mindegyik mintánál a ng-ban mért hisztaminértéket elosztjuk három totálkísérlet (l>erklórsawal Ijzisnek alávetett sejtek) átlagával a százalékos kiválasztás kiszámítása céljából. A kontrollmínták tartalmaznak antigént, de nem tartalmaznak kísérleti vegyületet. A vakminták (vagy spontán kiválasztási minták) sem antigént, sem kísérleti vegyületet nem tartalmaznak. A vakmlnták (háromszoros ismétlés) átlagát levonjuk a kontrollmintáknál és a kísérleti vegyületekkel kapott mintáknál mért százalékos kiválasztásból. A kontrollmintáknál és a kísérleti vegyületekkel kapott mintáknál az átlagértékeket kiszámítjuk, egy adott kísérleti vegyületre a következőképpen számítva a százalékos kiválasztást: kísérleti vegyülettel %-os hisztaminkiválasztás-------------—--------------------------—---------- loo kontrollal %-os hisztaminkiválasztás A kísérleti vegyület különböző koncentrációinál kapott értéket használjuk az EDJ0 (az a mikromólban kifejezett koncentráció, amelynél a hisztaminkiválasztás 50%-ban gátolt) számítására lineáris regreszszióval. Egy vegyületet akkor tekintünk hatásosnak, ha ED50 értéke azonos vagy kisebb 48 mikromólnái. Néhány jellegzetes (!) általános képletű vegyületre a kapott eredményeket az táblázatban adjuk meg. 1, táblázatban Immunológjailag ingere!t humán basophil-sejtek általi hisztaminkiválasztás gátlása Kísérleti vegyület EdJ0 (mikromól) 4(5,8-Di hidro-5,8 -dioxo-6 -kinoxalinil)- 3,7-5 -piperazin -karbonsav-etilészter 6 (-4-[3-(Trifluor metil)-fenil] 1-pipera- 6,6 z;nil]-5,8-kinoxalin-dion 6 [4-(2-Benzotiazolil)-l-piperazinil]-5,8 1,2-kin oxalin -dión 4 (5,8-Dihidro-5,8 -dióxo-6-kinolínil)-1 - 17,4-piperazin-karbonsav-etilészter 6 [4-(fenil-metil)-l-piperazinil]-5,8-kino- 12,1 lin-dion A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeknek lipoxigenáz aktivitást gátló hatását a leukotrién B4 (LTB4) és az 5-hidroxi-eikozatetraén-karbonsav (5-HETE) kiválasztásának és bioszintézisének gátlásaként a következő képpen határozzuk meg. Ennél a kísérletnél tengeri malacoktól nyert, 3.107 számú peritoneális neutrophil-sejtet 37 °C-on 50 mikromólos tris-puffert (pH = 7,4) tartalmazó Dulbecos-pufferben inkubálunk. 100 mikromól arachidonsav és 20 mikromól kalcium-ionofor (A23187) adagolását megelőzően 5 perccel a neutrophil-sejtekhez kontroll vivöanyagot vagy 10 mikrogramm/ml koncentrációban kísérleti vegyületet adunk. Az arachidonsav és a kalcium-ionofor adagolása után 30 perccel az összes lipidet megosztjuk kloroformban azután, hogy a pH értékét 3-ra beállítottuk citromsavval és azonos térfogatarányban metanolt és kloroformot adagoltunk. Az 5-HETE és az LTB4 egymástól való elválasztá98.037 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
