197945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptid antibiotikumok és ilyen hatóanyagot tartalmazó készítmények előállítására
197945 bikos fermentáció útján kapott inokulum-kultúra 500 ml-nyi adagját alkalmaztuk. A fermentációt 28°C hőmérsékleten, 250 percenkénti fordulattal végzett keverés és percenként 10 liter levegőztetés mellett folytattuk le. Az antibiotikum-termélés 40 órai fermentáció után 150 pg/ml maximumot ért el. Az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása 48 1 fermentlevet Sharpless-centrifugán centrifugáltunk. A micélium-pogácsát 7 liter metanollal homogenizáltuk és ezt az elegyet 1 óra hosszat kevertük. Az oldhatatlan részek kiszűrése után a metanolos kivonatot bepároltuk; a visszamaradó vizes oldatot egyesítettük a fermentlé szűrletével és 24 1 butanollai extraháltuk. Az extraktumot 0,5 1 térfogatra bepároltuk és ezt keverés közben 3,5 liter n-hexánban öntöttük, a nyers antibiotikum lecsapása céljából. Az így kapott 41 g szilárd nyers antibiotikumot 760 ml C-200 szilikagélt tartalmazó oszlopon kromatografáltuk; etil-acetáttal és 0%-tói 50%-ig növekvő metanoltartalmú etil-acetáttal eluáltunk. Az eluátum bioaktivitását papírkorong módszerrel vizsgáltuk, Candida albicans A9540 mikroorganizmus alkalmazásával. Az aktív frakciókat egyesítettük és bepároltuk; maradékként 13 g BU-2867T komplexet kaptunk halványsárga por alakjában. E szilárd termék 200 mg-nyi részét egy fordított fázisú oszlopon (C18, 100 ml) kromatografáltuk, 3:7—5:5 térfogatarányú etanol-víz eleggyel eluáltunk. Az eluátümot antifungális bio-próbával, valamint vékonyréteg-kromatográfiai módszerrel (szilán-bevonattal, etanol és víz 55:45 técfogatarányú elegyével) vizsgáltuk. Az eluálás során három különálló szakaszban kaptuk az aktív anyagot tartalmazó frakciókat. Az első szakaszbeli aktív frakciókat egyesítettük és csökkentett nyomáson bepároltuk; így 61 mg BU-2867T A antibiotikumot kaptunk tiszta fehér szilárd termék alakjában. Ezt vizes metanolból átkristályosítva 34 mg tisztított terméket kaptunk' színtelen tűkristályok alakjában. A második és harmadik szakaszbeli aktív frakciók külön-külön történő egyesítése és bepárlása útján 1 mg BU-2867T B, illetőleg 11 mg BU-2867T C antibiotikumot kaptunk. A BU-2867T C antibiotikum metanolból finom tűkristályok alakjában kristályosodik. A fent leírt fordított fázisú kromatográfiai tisztítás megismétlése forán összesen 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B és 342 mg BU-2867T C terméket kaptunk. Az antibiotikumok jellemzése A BU-2867T A és C antibiotikumokat színtelen tűkristályok, míg a BU-2867T B antibiotikumot fehér amorf por alakjában kaptuk. Ezek a termékek könnyen oldódnak metanolban, etanolban, n-butanolban és dimetil-szulfoxidban, kevéssé oldódnak kloroformban, acetonitrilben és etil-acetátban, míg n-7-hexánban és vízben gyakorlatilag oldhatatlanok. Mindhárom antibiotikum Rydon-Smith reagenssel pozitív reakciót ad; vékonyréteg-k^omatográfiai lemezen jóddal vagy kénsavval permetezve színeződik. Negatív reakciót adnak ninhidrinnel, Sakaguchi-reagenssel, antronnal és a Dragendorff-reakcióban. A három antibiotikum elemzéssel megállapított tapasztalati képlete: BU-2867T A: C27H44N406 BU-2867T B: C29H46N406 BU-2867TC: C29H48N406 Az elemzést tömegspektrometriai és mikroanalitikai módszerrel végeztük. A három antibiotikum metanolban mért ibolyántúli színképe egyetlen maximumot mutat 261 nm-nél; ez a maximum savas vagy alkalikus oldatban nem tolódik el. A BU-2867T A, B és C fizikai-kémiai jellemző adatait a 4. táblázatban foglaltuk össze. A három termék infravörös színképét (kálium-bromidban) az 1., 2. és 3. ábra szemlélteti; ezek a színképek erős anid-sávokat mutatnak 1630 és 1540 cm-1 körül és -OH és/vagy -NH-NH abszorpció-s ívokat 3300 cm-1-nél. A BU-2867T A 'H-NMR színképe (4. ábra) hat olefines proton jelenlétét (ő: 6,16, 6,20 (2H), 6,28, 6,49 és 7,09 ppm) és négy amid-proton (ő: 7,49, 7,82, 7,87 és 8,72 ppm) jelenlétét mutatja. Két metilcsoport (ő: 0,93 ppm, t és 1,07 ppm, d) jelenléte is megfigyelhető a színképen. A BU-2867T A l3C-NMR színképe (5. ábra) 23-nál több szénatom-szignált mutat, ezek között négy karbonil-szénatom, 6 olefines szénatom és 3 metil-szénatom szignálja látható. A BU-2867T B és C antibiotikumok l3C-NMR színképe igen hasonló a BU-2867T A antibiotikuméhoz, csupán azzal az eltéréssel, hogy a BU-2867T B színképében két további olefines szénatom, a BU-2867T C színképében pedig két további metilén-szénatom jelenléte látható. A BU-2867T A antibiotikumot 6 n sósavban 16 óra hosszat forraltuk visszafolyatás közben. Az (V) lipofil termék etil-acetátos extrakció útján való eltávolítása után a hidrolizátumot bepároltuk és a kapott olajszerű maradékot Dowex 50WX4 ioncserélő gyantán kromatografáltuk, előhívószerként piridin-hangyasav-ecetsav puffert (0,1—0,2 mólos, pH 3,1—5,1) alkalmaztunk. Ninhidrin-reagenssgl ellenőrizve négy aminosavat (I, II, II és IV) eluáltunk ebben a sorrendben; elkülönítésük és kikristályosításuk bidroklorid alakjában történt. Az (I) aminosavat ([a]25= = — 12,7°, 5 n HCl-ben) fizikai-kémiai tulajdonságai alapján L-treoninként azonosítottuk. A (II) aminosav 'H-NMR és EI-MS (M++l: m/z 134) színképe azt mutatta, hogy ez a termék a 4-amino-3-hidroxi-n-valeriánsav két diasztereomerjének elegye; vö.: M. Konishi, K. Saito, K- Numata, T. Tsuno, K- Asama, H. Tsukiura, T. Naito és H. Kawaguchi: Tallysomycin, A new antibiotic complex related to bleomycin, II. Structure determination of 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
