197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 lik az uvrB génen is, akkor benyúlhat a biotin operonba is és valószínűleg a szerkezeti lambda génekbe is. Ezzel a módszerrel sikerült szerkezeti lambda gén deléciót elérni [Grier, Virology 66: 589—604 (1975)]. Valamennyi ultraibolya sugárzással szemben érzékeny chlA“, lambda lizogént X virA- {ággal megfertőztük. Két és fél óra eltelte után a lizálódott tenyészetet lemezre vittük a XvirA~ íág és a kvirA+ rekombinánsok kimutatása céljából. Azokat a baktériumokat, melyek szaporítják a kvirA- fágot és/vagy A,virA+ fágot hoznak létre, eldobtuk; azoknál a baktériumoknál, melyek nem egészítik ki a kvirA~ fágot, illetve nem termelnek virA+ fágot olyan deléció történt, mely a lambda fág DNS láncán a chlA géntől indul ki és átmegy az A génen is. Ez utóbbi baktériumokat a litikus tulajdonság kimutatására viszgáltuk (lízis 38°C fölött történő tenyésztésnél). A litikus baktérium tulajdonságot megtartó, a deléciót tartalmazó egyedeket az MG4 törzsként tisztítottuk. 8. Példa MM294(cl857) és UC5822 baktériumtörzsek klónozása MM294 E. coli törzset (ATCC 33625) kcI857 fág jelenlétében inkubáltunk. Egy éjszakán át 32°C-on történő tenyésztés után az életben maradt baktériumokat izoláltuk és megtisztítottuk. Azokat a kiónokat, melyek immunisak a felülfertőzéssel szemben, és amelyek 44°C hőmérsékleten nem képesek fejlődésre és fágképzésre, izoláltuk. Az így kapott cI857 lizogén baktériumtörzset, az MM294 (A,c 1857) törzset, és az UC5822 E. coli törzset CaCl2 kezeléssel kompetenssé tettük és pDN5 plazmiddal transzformáltuk, amely plazmid az E. coli LT-B antigén és az ampicillin és tetraciklin rezisztencia génjét hordozza. Mindkét litikus baktériumtörzs ampicillinnel és tetraciklinnel szemben rezisztens transzformált sejtjei jól fejlődtek a standard húsleves táptalajon 30—32°C-on és LT-B antigént termeltek. A baktériumokat centrifugálással üledékbe vittük, és 42°C hőmérsékletű standard húsleves tápközegbe vittük. Körülbelül 90—120 perc alatt a lízis bekövetkezik, és lényegében be is fejeződik. Az LT-B antigén felszabadult, és a húslevesbe jutott. Milliliterenként 4X107 MM294(cI857) transzformálást tartalmazó mintában körülbelül 2X108 lambda fág mutatható ki. A hasonló LTC5822 transzformáns mintában nem mutatható ki fág (20 fágnál kevesebb ml-enkérit). 17 9. Példa UC5822 baktériumtörzs klónozása Az E. coli LT-B antigén termelését kódoló géneket hordozó pESS2 plazmidot tartalmazó E. coii UC5822 baktériumtörzset egy 5 ml-es kémcsőbe oltottunk, melyben ampicillint tartalmazó L húsleves táptalaj volt. 6 óra eltelte után a kémcső tartalmát átvittük ampiciilint tartalmazó 500 ml térfogatú tápközegbe, majd egy éjszakán át, rázás közben inkubáltuk 32°C-on. 10 1 tenyészet készítéséhez az előbbi kultúrából 400 ml-t átvittünk 10 1 tápközegbe, mely ampiciilint tartalmazott, és az egészet egy Virtis bench-top fermentorba helyeztük. A tenyésztést 32°C-on végeztük, és óránként 100 ml mintát vettünk a növekedés mértékének megállapítására A420 refrakció érték mellett. 4 óra elteltével a tenyészethez 200 ml 50%-os glükózt és 0,1 ml habzásgátló anyagot adtunk. 8 óra eltelte után a kultúra 4,8 A420 stádiumban volt, és a hőmérsékletet 43°C-ra emeltük. 10 óra eltelte után a tenyészethez ismét 200 ml 50%os glükózt adagoltunk, és a kézdéstől számított 14 óra elteltével a tenyésztést megállítottuk. A sejtkoncentrátumból (üledék) és a felülúszóból a tenyésztés kezdetétől számított 4; 6; 8; 9; 10,6; és 14 órakor vett mintákat LTß-re nézve vizsgáltuk ELISA-val, standardként ismert koncentrációjú LTß-mintákat alkalmazva. A kapott eredményeket az 1. táblázat mutatja. A tenyésztés kezdetétől számított 4—8 óra között LT-B antigén 90%-ánál nagyobb része a sejtekben maradt, azonban a hőmérséklet emelése után 2 órán belül (a beoltás után 10 órával) az LT-B antigén 90%-a a felülúszóban volt. A hőmérsékletváltoztatás után 6 órával az LT-B antigén 95%-a került a felülúszóba. Az LT-B antigén az összfehérje 8,5%-át adta. Az LT-B hozam sokkal jobb volt, mint a pESS2 plazmiddal transzformált MM294 E. coli törzs hozama. A hőmérsékletváltás után 2—4 órán belül a tápközeg viszkozitásának növekedéséből és a látható sejttöredékből nyilvánvaló volt, hogy lízis történt. A hőmérsékletváftás után 4—6 órával a táptalaj viszkozitása jelentősen csökkent, és a táptalajt könnyen át lehetett szűrni egy ultraszürőn a sejttörmelék és a megmaradt, nem lizálódott sejtek eltávolítása céljából. A megnövekedett viszkozitás azt mutatja, hogy nagy molekulatömegű DNS és RNS molekulák szabadultak fel és jutottak a tápközegbe. Az endogén nukleáz enzimek tevékenysége azonban végsősoron azt eredményezte, hogy csökkent az oldat viszkozitása. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10
