197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 gén MG1 baktériumokat tisztítottuk, és az MG2 baktériumtörzs elnevezést kapták. Az N99 baktériumtörzset (ATCC 33956) az MG2 baktériumtörzsön tenyésztett PlcmlOO tággal PlcmlOO transzdukció révén kereszteztük. A tetraciklinnel szembeni rezisztenciával rendelkező baktériumokat kiválasztottuk. Valamennyi ilyen baktériumot a lambda tággal szemben immunisnak találtuk, igy megállapítottuk, hogy a lambda lizogénekké váltak. E lizogének közül egyet megtisztítottunk és MG3 [N99 (M58—71 cI857 P3 029)] törzsnek neveztük el. Az MG3 törzsről megállapítottuk, hogy 90—120 percig tartó 44°C-os hőmérséklet hatására lízisen megy keresztül. A sejtkultúrákban nem találtunk fágokat sem az előbb említett kezelés előtt, sem utána (3,3X108 baktériumsejtet tartalmazó tenyészetben 1 tágnál kevesebb 0,1 ml-enként). A fágok jelenlétét a C600 baktériumsejteken vizsgáltuk. A nem hibás lambda fágokat tartalmazó, kontrollként alkalmazott E. coli törzsek 105—109 fágot tartalmaztak ml-enként olyan baktériumtenyészetben, melyben ml-enként 3,3X10® baktériumsejt volt. 15 5. Példa MG3 baktériumtörzs előállítása Az MG3 baktériumtörzset lényegében hasonlóan a 4. példa szerinti módszerhez állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy az N99 törzsnek a A,cI857 P3 029 tággal történő lizogénné tétele közvetlenül történt. A kapott lizogén baktériumot Pl transzdukcióval kereszteztük az MGO-AR18 baktériumtörzzsel és kiválasztottuk azokat a tetraciklinnel szemben rezisztens lizogéneket, melyek hőmérsékleti indukció hatására lízist szenvednek el, azonban fágokat nem termelnek. 6. Példa UC5822 baktériumtörzs előállítása Az UC5822 baktériumtörzs előállítása az N99 baktériumtörzs A.int6 red3 cI587 P80 és X,hy5 climm21 Ab2 fágokkal történő fertőzése révén történhet. A Xhy5 climm21 Ab2 fág a Mág és a 21-es fág hibridje. Ebben az esetben a Xhy5 climm21 Ab2 fág célja az, hogy biztosítsuk az int funkció bevitelét a trans génbe, mely, ahhoz szükséges, hogy a Aúnt6 red3 cI857 P80 fág lizogénné tegye ezt a törzset. A Ab2 mutáció alkalmatlanná teszi a Miy5 climm21 Ab2 fágot arra, hogy irányítsa a saját beépülését e baktériumtörzsbe. E keresztezésből azt a baktériumot, mely immunisnak bizonyult a lambda vírussal történő felülfertőzéssel szemben, azonban érzékeny volt a 21-es fágra, tisztítottuk és az UC5822 baktériumtörzs elnevezést kapta. Ez a törzs elpusztul, ha 44°C hőmérsékleten tartjuk. Nem lehet fágot kimutatni az UC5822 baktériumtörzsnél sem a 44°C-os hőmérsékleti kezelés előtt, sem utána. 7. Példa Az MG4 baktériumtörzs előállítása MG3 baktériumot tenyésztünk Luria tápközegben vagy más teljesértékű táptalajon 32°C hőmérsékleten a logaritmikus szaporodási fázis középértékéig (azaz A650=0,5 értékig). Ekkor a táptalaj megközelítően 5X10® baktériumsejtet tartalmaz ml-enként. A baktériumtenyészetet ekkor 0,2% glükózzal és 0,2% KC103-al kiegészített Nutrient agar táptalajra (lemezre) visszük. Az agar lemezeket anaerob körülmények között 32°C-on inkubáljuk, amíg baktériumkolóniák nem keletkeznek (3—5 nap alatt). E táptalajon, a fenti körülmények közötti tenyésztés során kiválasztódnak azok az E. coli baktériumok, melyek a chl A, B, C vagy D génekben mutációval rendelkeznek. [J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, 226—227]. A chlB, C vagy D gének mutációja még nem vezet az MG4 baktériumtörzs kiválasztásához. A chlA gén kifejezésére ható mutációk között a chlA pontmutációi és a chlA- től jobbra vagy balra • kiterjedő deléciók is vannak. A DNS láncon a chlA géntől balra kiterjedő deléció a szomszédos uvrB gén felszakadását (felbomlását) eredményezheti, mely eredményeképpen ultraibolya sugárzással szembeni érzékeny baktérium fenotípus jön létre. Ugyanilyen ok miatt, ha a deléció a chlD géntől jobbra történik a DNS láncon, akkor is ultraibolya sugárzással szemben rezisztens baktérium fenotípust állíthatunk elő. \z anaerob inkubálásból származó, kloráttal szemben rezisztens kolóniákat vizsgáltunk, hogy a kapott baktériumok érzékenyek-e az ultraibolya sugárzással szemben. E műveletet úgy Végezhetjük el, ha egy Petri csészében egy kloráttal szemben rezisztens kolóniát szélesztünk, a csésze felét letakarjuk, és a másik felét 10 J/m2 erősségű 254 nm ultraibolya sugárzásnak vetjük alá. Ez a dózis elegendő ahhoz, hogy elpusztítsa az ultraibolya sugárzással szemben érzékeny baktériumsejteket, azonban a rezisztens mutánsokat nem. Az ultraibolya sugárzással szemben érzékeny mutánsokat (melyek közé a chlA és chlD génmutációk is tartoznak) megvizsgáljuk, hogy található-e bennük hibás lambda profág. Ezt úgy végezzük, hogy egy Petri csészében szélesztett homoimmun fágon keresztben szélesztjük a vizsgálandó baktériumokat, ezeket a fágok az érintkezési helyeken elpusztítják, azonban a lambda lizogének immunisak a felülfertőzéssel szemben, így nem pusztulnak el. A chlA és a chlD gének, a lambda genom és az uvrB gén elhelyezkedéséből eredően valamennyi- ultraibolya sugárzással szemben érzékeny chlD mutáns lambda fággal szemben érzékeny lesz, míg néhány ultraibolya sugárzással szemben rezisztens chlA mutáns lambda lizogén lehet. Az ultraibolya sugárzással szemben érzékeny lambda lizogéneknél tehát olyan chlA deléció történt, mely a DNS láncon balfelé, az uvrB-be nyúlik. Ha a deléció túlnyú-16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
