197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 cionális lizozim-kódoló géneket tartalmaz úgy, hogy a lizozim-kódoló gének permisszív körülmények között gátolva vannak, míg restriktiv körülmények között kifejeződnek; b) egy, a többi közül kiválasztható marker; valamint c) egymással szomszédos szekvenciák, amelyek a gazdasejt kromoszómájában lévő szomszédos szekvenciával homológok. A találmány tárgyát képezi litikus baktérium előállítási módja is, mely szerint egy baktériumot a találmány szerinti DNS fragmenssel transzformálunk. A találmány szerinti eljárással előállított termékkel emlősök kezelhetők oly módon, hogy a termék hatékony dózisát tartalmazó hőmérsékletérzékeny baktériumot adunk az emlősöknek és a baktérium fala az emlős belsejében bomlik fel, és a termék ott szabadul ki. A hőmérséklettel szemben érzékeny baktériumok olyan profág DNS szekvenciát hordoznak, mely egy hőmérséklettel szemben érzékeny represszor gént tartalmaz úgy, hogy ha a baktériumot egy bizonyos hőmérsékleti tartományban (permisszív körülmények között) tenyésztjük, a represszor működik, azonban ha egy másik hőmérsékleti tartományban (restriktiv körülmények között) tenyésztjük, a represszor nem működik; vagyis a represszor nem fejeződik ki vagy nem stabil. Restriktiv körülmények között a fág gének — beleértve a fág lizozim géneket is — kifejeződnek, ami a gazdasejt falának lebomlását (lízisét) idézi elő. Az ilyen hőmérséklettel szemben érzékeny baktériumok litikus baktériumok. A fentiek szerint definiált bármely litikus baktérium felhasználható a találmány szerinti eljárásban. Hőmérséklettel szemben érzékeny, mérsékelt fertőzőképességű fág represszor gének hozzáférhetők, vagy ilyen gének már ismert eljárással történő mutációjával előállíthatok. Például Campbell [Virology 14, 22— 32 (1961)] ismertet egy eljárást a hőmérséklettel szemben érzékeny fág mutánsok izolálására. Az eljárás általában a következő: a) a tággal fertőzött baktériumot mutagenezisnek vetjük alá — például ultraibolya besugárzással —; majd b) a túlélő baktériumokat magas hőmérsékleten inkubáljuk, hogy hőmérséklet érzékeny represszor mutánsok képződését inkubáljuk; c) ezeknek lizátumával érzékeny baktériumokat fertőzünk meg; d) az új lizogén baktériumokat hőhatással indukáljuk és a hőindukció után keletkező fágokat használjuk az érzékeny baktériumokból történő lizogén fágok előállítására. Ezzel a ciklussal (lizogén előállítás, indukció, ismételt előállítás) fág represszor mutánsok hozhatók létre. Általában 3—4 ilyen ciklus elegendő ahhoz, hogy ilyen mutánsokat kapjunk. A következőkben a leirás elsősorban litikus E. coli baktériumra—elsősorban cI857 E. 5 4 coli lizogén baktériumokra — vonatkozik. Azonban a leírás alapján bármely, az adott területen átlagos jártassággal rendelkező szakember képes bármely más litikus E. colit vagy más litikus baktériumot előállítani a lambda fágból vagy más mérsékelt fertőzőképességű fágból — mint például a fentemlített mérsékelt fertőzőképességű fágokból — származó represszor gén és endolizin enzimet kódoló gének alkalmazásával. A cI857 lizogén baktérium törzsek — melyek ismertek és könnyen hozzáférhetők — olyan cl represszort termelnek, mely aktív 38°C-on vagy ez alatt, azonban 38°C felett inaktív. E baktériumok előnyösebbek, mint a többi hőmérséklet érzékeny E. coli lizogén törzs, mivel amellett, hogy olyan mutációt tartalmaz, mely a represszort 38°C felett inaktívvá teszi, a cI857 gén tartalmaz egy másik mutánst is, mely a cl represszor proteint érzéketlenné teszi a lambda recA gén termékével történő proteolitikus bontással szemben, így, ha permisszív körülmények között tenyésztjük, a cl represszor protein stabil és ennélfogva hatékony az immunitás fenntartásában. Az UC5822 E. coli törzs egy olyan lizogén baktériumtörzs, mely a cI857 gén mutációt tartalmazza. Emellett egy pontmutációt is tartalmaz az int génben (int 6 am, egy amber mutáció) és a P génben (P3 am, egy amber mutáció). (A transzláció végét az amber mutációk jelzik). Az UC5822 törzset általában előnyben részesítik példul az MM294 (cI857) törzzsel szemben, mivel hibás, azaz általában nem termel fertőzőképes fágrészeket. A hibás lizogén baktériumokat szívesebben alkalmazzák, különösen akkor, ha polipeptideket emlősökbe juttatnak be. Az UC5822 törzs azonban kevesebb lizozim enzimet termel, feltehetően azért, mert kevesebb számú S és R génmásolatot tartalmaz, mint az MM294(cI857) törzs, azaz az indukció befejezése után 50—100-szor kevesebbet. Ennek ellenére az UC5822 baktérium törzs esetén is az indukció után a lízis közvetlenül bekövetkezik. A találmány szerinti eljárás értelmében a hőmérséklettel szemben érzékeny baktériumot olyan DNS molekulával (molekulákkal) transzformáljuk, mely közvetlenül vagy közvetett úton a kívánt termék előállítását kódolja. A transzformáció történhet bármely olyan eljárással, mely lehetővé teszi, hogy a DNS molekula bejusson a gazdasejtbe és ott a termék kifejeződjék. A DNS molekula bevitele történhet például transzformációval, transzdukcióval, konjugációval és sejtfúzióval. Erre a célra alkalmas sokféle expreszsziós vektor, valamint gének klónozására és sejtek transzformálására alkalmas eljárások jól ismertek és hozzáférhetők. A kapott termék általában egy ki nem választott heterológ (nem homológ) géntermék, azaz egy olyan termék, melyet a gazdasejt természetes körülmények között nem állít elő és nem választ ki. A 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
