197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 közvetlen módon előállított termékek lehetnek például polípeptidek; a közvetett módon előállított termékek pedig például polípeptidek, glikoproteinek, antibiotikumok és más molekulák lehetnek, mint például fémionok, amelyek metallotioneint előállító baktériumokban termelődhetnek. A transzformált cI857 lizogén baktériumok tetszés szerint tenyészthetők permisszív, a kívánt termék előállítása szempontjából optimális körülmények között (azaz s£38°C, előnyösen 32—36°C között). Amikor elérjük a megfelelő növekedést, azaz rendszerint a logaritmikus növekedési fázis közepén (azaz, ha A65o=0,5), akkor a lambda endolizin enzim szintézisét indukáljuk úgy, hogy a lizogén baktériumot restriktiv körülmények között tenyésztjük. Ezt úgy érhetjük el, hogy a tápközeg vagy koncentrátuma hőmérsékletét emeljük — például a cI857 baktérium törzs esetén 38°C fölé, előnyösen 42—44°C közé—körülbelül 90—120 percig. Más módon úgy is eljárhatunk, hogy a tápközeg, illetve koncentrátuma hőmérsékletét 38°C fölé, előnyösen 42—44°C közé emeljük rövidebb időtartamra — előnyösen legalább 5 percre — vagyis annyi ideig, mely elegendő ahhoz, hogy a fág DNS-ét indukálja, majd ezt követően a hőmérsékletet csökkentjük 0—38°C-ra, előnyösen 2—36°C-ra. A restriktiv körülményeket célszerűbb 90— 120 percig fenntartani, mert így a lízis hatékonyabb és gyorsabb. Azonban a rövidebb ideig tartó (második) eljárás egyes esetekben — például amikor a végtermék hőre érzékeny fehérje vagy a restriktiv körülmények fenntartásának költsége túl magas — mégis előnyösebb lehet. Ha cI857 lizogén gazdasejt tartalmaz egy funkcióképes lambda cro gént, akkor a sejt bármely, a gazdasejt működéséhez megfelelő hőmérsékleten folytatja a lizozim enzim szintézisét, mindaddig, ameddig a lízis be nem következik. Bár a lambda endolizin még 0°C-on is aktív, a lízishez szükséges idő alacsony hőmérsékleten nagyobb, mivel a fehérjeszintézis sebessége kisebb és általában a katalitikus aktivitás csökken. Előnyös, ha az indukció előtt vagy közvetlenül az indukció után koncentráljuk a baktériumsejteket — szűréssel, centrifugálással vagy más módon — és a baktériumokat a lízisig ebben a koncentrált állapotban inkubáljuk. Az ilyen eljárás a kívánt végtermék összegyűjtését és tisztítását segíti elő. Az inkubáció után a baktérium sejtfala lényegében lebomlik. A sejtek protoplaszt formában továbbra is szintetizálják a kívánt terméket, és a termék zöme a sejtmembránon keresztül a tápközegbe jut. A kívánt termékek teljes mennyiségének a baktériumból való kijutását lízissel érhetjük el. A lízis folyamatát a tápközeg vagy ennek koncentrátuma kitisztulása és/vagy ezek viszkozitásának növekedése mutatja. A lízis folyamatát elősegíthetjük például mechanikus úton ke7 veréssel vagy a tenyészkörülmények gyors változtatásával, mint például a hőmérséklet gyors változtatásával 2 és 25°C között vagy a tápközeg, illetve a koncentrátum ozmózis nyomásának a változtatásával. A sejtek koncentrálása és a terméket tartalmazó felülúszó dekantálása után az indukált sejteket előnyösen minimál puffer sóoldatban vagy 0,1 mól/l tris puffert, 50 milíimól/1 NaCl-t és 1 millimól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban szuszpendáljuk és keverjük. A kívánt terméket a tápközegből, illetve a koncentrátumból ismert módszerekkel nyerhetjük ki, vagy ha szükség van rá, tisztíthatjuk. Alternatív módszer a kívánt termék előállítására, hogy az egészben lévő baktériumsejteket koncentráljuk és a litikus fázis indukálása előtt szájon át juttatjuk be az emlősök szervezetébe. Az indukció így az emlősök szervezetén belül megy végbe, így ott szabadul fel a kívánt polipeptid. Ez a módszer különösen az antigének állatok szervezetébe történő bejuttatásának olyan eseteiben hasznos, ha előnyös, hogy az egész baktériumsejtek és a kívánt antigén védő immunreakciót váltson ki. így például antigének, mint például az LT-B antigén, termelését kódoló géneket hordozó hőmérséklet érzékeny lizogének közvetlenül szájon át bevihetők malacokba és/vagy borjakba. Az egyes állatokba bejuttatandó sejtek mennyisége anynyi, amennyi a hatásos dózist biztosítja. Az egységnyi mennyiségű sejt által termelt protein mennyisége ismert módszerekkel kiszámítható. A találmány szerinti eljárás kiterjed egy DNS fragmens előállítására is, mely a litikus baktérium fenti kialakításában használható. Egy ilyen DNS fragmens egy hőmérséklettel szemben érzékeny represszor gént és működő lizozim kódoló géneket tartalmazó hibás fág szekvenciát tartalmaz. Az ilyen hibás lambda fág szekvenciát tartalmazó DNS fragmens olyan hőmérsékletre érzékeny cl gént, valamint működő lambda endolizin termelést kódoló géneket (N, Q, S és R gének) tartalmaz, hogy az endolizin restriktiv körülmények között fejeződik ki, továbbá van egy szelektálásra alkalmas jelölője és előnyösen rendelkezik olyan szomszédos DNS szekvenciával, mely homológ a gazdasejt kromoszómájának szomszédos DNS szekvenciájával. Egy speciális esetben a DNS fragmens egy olyan lambda DNS-t tartalmaz, melyben a kromoszómatérkép 58. és 71. helye közötti gének delécióval kiestek, így hiányzik az int, xis és a kil gén; van egy hőmérsékletre érzékeny cl génje; mutációkkal rendelkezik az O és a P génekben; a cl gén megfelel a c!857 mutánsnak és endolizint termel restriktiv körülmények kö-8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
