197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 A találmány tárgya, eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok termékeinek a mikroorganizmusból való kinyerésére. A kívánt fehérjéket előállító E. coli és más prokariota mikroorganizmusok gazdasejtként történő alkalmazásánál gyakori probléma az, hogy miként nyerjük ki a fehérjét a gazdasejtből tisztítás céljára. E problémát például úgy kísérelték meg megoldani, hogy a sejteket fizikai úton, homogenizálással vagy szonikus módszerrel vagy vegyi úton (felületaktív anyagok vagy lizozim enzim segítségével) roncsolták vagy egy, a jelentős pepiid kiválasztását kódoló DNS szekvenciát kapcsoltak a kívánt termék előállítását kódoló szerkezeti génhez. Például Weissman és társai (61 250. számú Európa szabadalmi bejelentés) egy olyan eljárást ismertetnek, melyben a gazdasejteket sejtfal feloldó (lizáló) vagy permeabilitást okózó anyagokkal kezelik. Silhavy és társai (4 336 336. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) egy olyan eljárást ismertetnek, melyben egy citoplazma fehérjét kódoló gént egyesítenek egy nem citoplazma fehérjét kódoló génnel úgy, hogy a fúzióval előállított gén olyan hibridet hozzon létre, amely a sejtfolyamatok révén a gazdasejt felszínéhez közel kerül vagy a sejten kívülre jut. Gilbert és társai (4 338 393 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) egy olyan eljárást ismertetnek, mely során úgy állítanak elő érett, kiválasztott proteineket, hogy egy preprotein előállítást kódoló szerkezeti gént visznek egy kiválasztást biztosító vektorba. Az E. coli baktériumot meg lehet fertőzni egy obiigát parazitával, a lambda fággal, mely egy dupla szálú DNS vírus. A lambda fág genetikáját az E. coli genetikájához hasonlóan sokoldalúan tanulmányozták. Például „A lambda bakteriofág" című munka is ezzel foglalkozik (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1971; kiadó A. P. Hershey). A lambda fág, mely egy mérsékelten fertőző fág, az E. coli baktériumban két fázisban szaporodhat. Az egyik, azaz a litikus fázisban a fág DNS-e önállóan replikálódik és a kapszid fehérjék képződését, a védőburok kialakulását és a gazdasejt lízisét irányítja. A lambda fág DNS képződése a litikus fázisban nagyon hatékony. A DNS szálak képződése során a láncfelépülés mindkét láncon történik; az egyik láncon jobboldali irányban, a másik láncon baloldali irányban. Indukált folyamatban 37°C-on 50 perc leforgása alatt mintegy 100 fág fragmens szabadulhat fel. [Hershey: „A lambda bakteriofág" (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1971)]. A másik, a lizogén fázisban a lambda fág DNS-e beépül a gazdasejt genomjába és paszszívan a gazdasejt kromoszóma DNS-ével együtt replikálódik a gazdasejt enzimjei ha- 2 1 tására. A lizogén szaporodási fázisban a fágot profágnak nevezzük, a gazdasejtet lizogénnek, és a fággal szemben immunisnak tekintjük. A gazdasejt az immunitást elveszítheti olyan tényezők miatt, melyek litikus fázist indukálhatnak. A lambda fág int és xis génje katalizálja a lambda genom E. coli genomjából történő delécióját, ezáltal egy kovalensen zárt kör keletkezik, mely önálló replikálódásra képes. E gének — és közvetett, vagy közvetlen módon a lambda fág valamennyi génje — szintézisét a lambda fág cl génje által termelt anyag elnyomja. Bizonyos vegyszerek vagy DNS-t károsító anyagok hatására a baktérium irányítja a bakteriális recA gén termékének szintézisét. A recA gén által termelt anyag proteolitikusan hasítja a cl represszor proteint, így lehetővé válik, hogy litikus fázisú gének kifejeződjenek. Ezt követően a fág szaporodásához néhány lambda szabályozó elem közötti kölcsönhatásra van szükség, mely végső soron azt eredményezi, hogy a lambda fág DNS-ének önálló replikálódása megkezdődik. A DNS replikálódásához a lambda fág P és O génjeinek termékére van szükség. A DNS replikálódását követően arra is szükség van, hogy a fág virális szerkezeti fehérjék, azaz fej és farok proteinek szintézisét és azok érintetlen, üres virionokba történő juttatását irányítsa. E művelethez legalább 18 gén kölcsönhatására van szükség. Végezetül a DNS beépül az üres virionba, így érintetlen, fertőzőképes viríonok képződnek. A Q génje által termelt anyag aktiválja a lambda S és R géneket, melyek az endolizin enzimet kódolják. Az endolizin hatására a baktériumsejt felreped és a fágok kiszabadulnak. A Q gén működését az N funkció aktiválja. Az N gén működését viszont a cl gén működése elnyomja. A kapszid burok képzéséhez szükséges 18 gén a jobb oldali átíró szálon a 3. és 36. hely között található, e helyek a teljes lambda DNS %-os értékeit jelölik. Balról jobbra az első gének: A, W és B, az utolsó pedig J. A normál lizogénekben a J géntől jobbra 8 bakteriális gén található. Ezek közül: a bio A, B, C, D és F, amelyek a biotin bioszintézisében vesznek részt. A hatodik, az uvrB, az ultraibolya sugárzással szembeni rezisztenciát viszi át. Az utolsó kettő, a chlA és E gén, a korátokkal szembeni érzékenységet viszi át. Erre vonatkozó utalást találhatunk Guest munkájában (Mol. Gen. Genet. 105, 285—289 (1969) és Stevens és társai „A lambda bakteriofág" (kiadó: Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1971., 515—534. old.) című munkájában. Egy másik lambda gén a kil gén, mely a természetes gazdasejt lízisfolyamatában vesz részt. A kil gén funkcióját ma még nem ismerjük teljes egészében. A kil gént kifejező sejtek növekedési sebessége csökkent mértékű az indukálódást követően. A kil gén működésé-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65
