197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására
197939 lyek különböző hosszúságú amino-termináiis szekvenciát tartalmaznak, és amelyek felhasználhatók egy sor expressziós (kifejeződő) vektorhoz. így például a gtll vagy pCQV2 használatához el kell távolítanunk a preproGRF iníciációs kodonjának teljes 5’-szekvenciáját. Ezután kémiailag szintetizált oligo-nukleotidokat kapcsolunk az emésztett dezoxi-ribonukleinsav-szegmens 5’-végéhez, amit a vektorok specifikációja szerint végzünk annak érdekében, hogy optimalizáljuk vagy egy hibrid, vagy egy fúziós géntermék termelését a tiszta preproGRF, proGRF vagy GRF fehérjék kifejezésének maximális szintjére. Az emésztett dezoxi-ribonukleinsav-szegmens reklónozása után linkereket kapcsolhatunk a 3’-véghez, és az így végtermékként kapott fragmenseket megfelelő endonukleázokkal emészthetjük, és izolálhatjuk a nagyobb plazmid dezoxi-ribonukleinsav elegyből poliakril-amid vagy agaróz-gélen végzett elektroforézissel. A hasított cDNS szegmensek mindegyike beépíthető a megfelelő kifejeződő vektor restrikciós helyére. Ilyenek például a következők: gtll [Young és Davis, PNA. Sei., 80, 1194— 1198), pCQV2 [Queen, J. Mol. and Appl. Genetics, 2, 1 —10 (1980)], pMB9-származék vektorok (Roberts és munkatársai, PNA. Sei., 76, 760—764 (1979)] vagy pBR322-ből származó vektorok [Jay és munkatársai, PNA. Sei., 785543—5548 (1981)] A rekombínánsexpresz-sziós vektorokat E. coli RR1 sejtekbe juttatjuk Peacock és munkatársai (lásd fent) szerint eljárva. A preproGRF-rokon cDNS-szegmenseket tartalmazó baktérium-telepeket dezoxi-ribonukleinsav hibridizációval szelektáljuk, a hibridizációt a B-próbával végezzük, de végezhetünk antitestekkel kivitelezett szűrést is [Young és Davis, lásd előbb]. A preproGRF géneket tartalmazó hibridizációs vizsgálatkor pozitív eredményt adó telepek közül 50-et kiválasztunk és tenyésztünk. A cDNS-vektor pontos szerkezetét restrikciós enzimmel kivitelezett analízissel határozzuk meg. Az E. coli-ban lévő bakteriális expressziós vektorok által meghatározott preproGRF-rokon peptidek termelését az egyes baktériumokban oly módon vizsgáljuk, hogy 'radioimmun-méréssel megmérjük a sejtekben levő GRF fehérje-szekvenciákat. Sejtlizátumot állítunk elő, a fehérjéket polivinil-klorid mikrotiter lyukakba helyezzük, GRF-specifikus antitesttel kezeljük, és az antitest-antigén komplexet 1125 jelzett A<-proteinneI mennyiségileg mérjük Kohler és munkatársai szerint [Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N. Y. (1980)]. Hét preproGRF -107 izolátum és tizenkét preproGRF-108 izolátum és tizenkét preproGRF-108 izolátum közül néhány lizátumában kimutattuk a GRF peptid-szekvenciát, ez jelzi, hogy a cDNS-molekulák kifejezik ezekben a sejtekben a genetikai információt, és protein jön létre. Egy preproGRF-107 génnel transzformált E. coli törzs jelentős mennyiségű pepiidet ter11 mel, amely reagál a megfelelő specifikus antitesttel. Ezt további tenyésztésre elkülönítjük. Ugyanezt tesszük egy preproGRF-108-rokon génnel teranszformált E. coli törzzsel is. A törzsek tenyészetéből lizátumot állítunk elő, és mindegyik lizátumot kromatográfiával és ezt követően polia 1 kiI-amid gél-elektroforézíssel frakcionáljuk. A kromatográfia után kapott protein-tartalmú frakciók közül azokat, amelyek 12 000 és 13 000 közötti molekulatömegű fehérjét tartalmaznak, affinitás-kromatográfiával tisztítunk Sepharose-oszlopot használva. A gyantát anti-GRF antitestekkel kapcsoltuk. Végezhetjük a tisztítást ioncserés kromatográfiával is, vagy bármely más, általánosan ismert módszerrel. Végül a tisztítást nagynyomású folyadékkromatográfiáva! fejezhetjük be (Guillemin és munkatársai, lásd előbb). Az egyes frakciókban levő preproGRF mennyiségét radioimmun-méréssel határozzuk meg, ennek során először különböző hígításokban inkubáljuk a frakciókat GRF-reaktív antiszérummal, és ezután 1125-jelzett GRF-44 termékkel kezeljük. A különböző hígításokban levő preproGRF koncentrációkat úgy számoljuk ki, hogy összehasonlítjuk az antitesthez kötődő és nem kötődő jelzett GRF koncentrációkat kontroliokból származó standard görbékkel. A kontroliokban a GRF antiszérumot ismert koncentrációjú, nem jelzett GRF termékkel kezeljük, és ezután a kezelést ismert koncentrációjú jelzett GRF termékkel ismételjük meg. Az eredmények szerint a tisztított frakciók mindegyike preproGRF terméket tartalmaz, a koncentráció teljes protein-tartalomra számítva 75—80 százalék. Bár a nem hasított preproGRF két alakja és a hibrid proteinek sem tartalmaznak bakteriális eredetű szekvenciákat, továbbá a GRF szekvenciák GRF-aktivitással rendelkeznek, ezek az anyagok mégsem értékes vegyületek. Egyébként, ha a prekurzor molekulákat állatoknak adagoljuk, úgy ezek in vivo GRF molekulákká hasadnak. Mindenesetre a preproGRF terméket in vitro hasítanunk kell úgy, hogy a preproGRF molekulákat humán hipotalamusz-kivonattai kezeljük, a kivonat hasító enzimeket tartalmaz. Valószínű, hogy található olyan nem humán eredetű hipotalamusz-kivonat, amely hasítja a humán preproGRF molekulákat és a GRF keletkezik. Mind in vivo, mind in vitro végzett enzimatikus preproGRF hasításkor a GRF-44 karboxil-terminális csoportja amidálódik. Ez megkülönböztető előnye a természetes génnek a kizárólag GRF aminosav-szekvenciát meghatározó szintetikus oligo-dezoxi-nukleotiddal szemben, ez utóbbi ugyanis nem tartalmazza a preproGRF-ben levő hasítható szekvenciákat. A hasítás végezhető részlegesen tisztított frakciókkal is, ezeket azután a fentiek szerint tisztíthatjuk tovább. Abban az esetben, ha a bakteriális kifejeződéskor az amino-terminális végen bakteriális szekvenciákat tartalmazó hibrid protein termék jön létre, úgy egy reagenssel, például cián-12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
