197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására
197939-bromiddal kivitelezett parciális hidrolízist kell végeznünk a preproGRF felszabadítására, és csak ez után végezünk in vitro hasítást a szövet-kivonatokkal. A baktériumokban való kifejezésre alkalmas preproGRF gén-fragmensek kifejezhetők eukarióta rendszerekben is, élesztőkben vagy emlős sejtekben. Élesztősejtek esetén az emlős interferonok szekretálódnak és hasadnak, ha a kifejezést élesztő-vektorral, az YEp,PT vektorral érjük el [Hitzeman és munkatársai, Science, 219, 620—625 (1983)]. A preproGRF hasonlóképpen előállítható és szekretálható, a szekretálódás könnyebbé teszi a tisztítást. Az izolált preproGRF ezután a fentiek szerint eljárva in vitro hasítható. A preproGRF terméket meghatározó cDNS-szegmenseket bejut' tathatjuk humán hipotalamusz sejtekbe vagy patkány hipofízis sejtvonalakba, ahol a jelenlevő enzimek képesek a preproGRF-107 és a preprol08 hasítására, A cDNS kiónozható olyan expressziós vektorokba, mint például a pSV2 vektorok, amelyek S V40-ből származnak [Mulligan és Berg, Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman szerkesztése, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York]. Klónozható a cDNS a legújabb retrovirus vektorokba is [Mulligan, Science, 209, 1422—1427 (1980)]. A cDNS bejuttatható a hipotalamusz sejtekbe mikroinjekcióval, dezoxi-ribonukleinsav-transzfekcióval vagy vírusfertőzéssel. A bejuttatott cDNS-t stabilan beépített sejteket szelekciós protokollal szelektálhatjuk, a szelekciót végezhetjük a vektor redszer által biztosított két domináns markerrei, a gpt vagy neo gének segítségével. A sejtvonalak által termelt GRF megfelelő antitestekkel az előzőekben megadottak szerint mérhető. Több sejtnek több GRF-et kell termelnie, mint a nem-transzformált sejteknek. így az izolált preproGRF cDNS alkalmas eukarióta sejtek transzformálására, és a kifejezett termék — legalábbis egyes esetekben — GRF termékké hasad a gazdasejt normális működése révén. Bár a találmány szerinti eljárást bizonyos előnyös kivitelezési módok alapján ismertettük, a témában jártas szakemberek számára nyilvánvaló módosítások végezhetők anélkül azonban, hogy kilépnénk a találmány oltalmi köréből. Érthető például, hogy az itt leírt preproGRF cDNS molekulák a természetben előforduló gén-szegmensek közül csak kettőnek a teljes szerkezetét reprezentálják. Nyilvánvaló, hogy kissé módosult allélek találhatók, amelyek hasonlóan működő proteineket határoznak meg. Ezeket a génszegmenseket és proteineket a találmány oltalmi köréhez tartozónak vesszük. Ugyancsak ismeretes, hogy a proteinek kissé módosított homológjai szintetizálhatok, és számtalan ilyen módosított homológ preproGRF-aktivitással rendelkezik. Ezek szintén a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Ekvivalens kodonokkal rendelkező dezoxi-ribonukleinsav ugyancsak a találmány oltalmi köréhez tartozik, mint ahogy pre-13 8 proGRF-aktivitással rendelkező peptideket leíró szintetikus génszegmensek is. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító faktor (hrGRF) prekurzort kódoló DNS — amely tartalmazza a teljes hpGRF peptid-szekvenciát, tartalmaz egy, az adott hpGRF pepiid amino-terminális végéhez kapcsolódó peptid-szegmenst, és egy, az adott hpGRF pepiid karboxil-terminális végéhez kapcsolódó peptid-szegmenst kódoló nukleotid-szekvenciát, ahol a fenti terminális szegmensek tartalmaznak egy adott hpGRF peptidről enzimes lehasadásukat és a hpGRF karboxil-terminális végének enzimes amidálását irányító szignál-szegmenseket — előállítására, azzal jellemezve, hogy — GRF-et tartalmazó humán hasnyálmirigy szövetből mRNS-t, majd ennek dúsításával poli-A+ mRNS-t izolálunk, —- ebből komplementer DNS-t (cDNS) szintetizálunk, és a cDNS-eket valamely plazmidba beépítjük, — ezekkel a plazmidokkal E. coli sejteket transzformálunk, — a transzformánsok telepeit a GRF szekvenciának részletével komplementer hibridizációs vizsgáló mintával hibridizálva átvizsgáljuk, — a vizsgáló mintával hibridizáló telepekből plazmidot izoláljuk, ezeket a plazmidokat linearizáljuk, és a linearizált plazmidokat a fenti vizsgáló mintával újra átvizsgáljuk, — a hibridizáló kiónokat kiválasztjuk, a hibridizáló klónokból a kifejezett termékek aminosav-szekvencia-elemzése alapján a preproGRF aminosav-szekvenciáját magában foglaló kiónokat kiválasztjuk, — és kívánt esetben további kiónok kiválasztásához valamely ilyen kiónt vizsgáló mintaként felhasználva hibridizációs átvizsgáláshoz felhasználjuk, — és bármely, fentiekben nyert kiónból a DNS-t kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg aminosav-szekvenciát kódoló DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott DNS-t tartalmazó hibridizáló kiónt választjuk ki. 3. Az l. igénypont szerinti eljárás Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-Ile-Leu-Thr-Leu-Ser-Asn-Ser-Ser-His-Cys-Ser- Pro -Pro -Pro -Pro -Leu -Thr -Leu -Arg -Met - Arg- Arg-Tyr-Ala-Asp -Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly'Q!n-Leu-$er- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I|e-Met-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-GJn-Glu-Arg- Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-G ly-Arg-Gin-Val- Asp-Ser-Met-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Met-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
