197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására
A 21. jellel jelzett klón nukleotid-szekvenciája szerint ez olyan polipeptidet ír le, amely tartalmazza a hpGRF-44 teljes aminosay-szekvenciáját, amit előzőleg protein mikroszekvenálással határoztuk meg. A hpGRF molekula leolvadási sémájában az iniciáló és termináló kodonok a hpGRF-44 kódoló szekvenciájától balra, illetve jobbra, a 31. és 32. kodonoknál heiyzekednek el. így ez a cDNS olyan preproGRF molekulát ír le, amely 107 aminosav hosszúságú, és rendelkezik a prepro hormon tipikus jellemzőivel [Steiner és munkatársai, Annals of New York Acad, of Sei., 243, 1 —16 (1980)]. Annak bizonyítására, hogy a cDNS fragmens szekvenálása után dedukcióval meghatározott preproGRF aminosav-szekvencia valóban megfelel az adott génterméknek, és nem a reverz transzkripció során keletkezett hibás termék, felhasználtuk a hasnyálmirigy tumorsejtekből kapott hírvivő ribonukleinsavat transzlációs termékek előállítására. A transzlációs termék molekulatömegét összehasonlítjuk az előre meghatározott preproGRF termék molekulatömegével. A hpGRF-44 mRNS transzlációját sejtmentes patkány retikulocita-rendszerben végezzük. A terméket specifikus antitestekkel immuncsapadékot képezve kicsapjuk. Az antitesteket szintetikus GRF termékkel állítjuk elő, és poliakril-amid gélen nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében elektroforézissel különítjük el. A legnagyobb transzlációs termék dublettként mozdul el, molekulatömege 13 000, ami jól egyezik a 21. számmal jelzett klón nukleotid-szekvenciájából dedukcióval megállapított preproGRF-107 molekulatömegével (12 361). Egy kisebb transzlációs termék szintén kettős termékként mozdul el (molekulasúlya 8 000), és a nagyobb termékhez hasonlóan, reagál a GRF specifikus antitestekkel. A kisebb molekulatömegű termék egy éretlen transzlációs termináció során jöhet létre, vagy a nagyobb pepiid hasítási terméke. A kettős csík megjelenésének oka ismeretlen. A fenti eredmények jelzik, hogy a nukleotid-szekvencia pontos, és és a 21. jellel jelzett klón cDNS fragmense tartalmazza a preproGRF-44 teljes kódoló szakaszát. Mivel bizonyítottuk, hogy a 21. jellel jelzett klón tartalmazza a preproGRF-44 teljes kódoló szekvenciáját, lehetségessé válik a rekombináns szegmens felhasználása abból a célból, hogy lokalizáljuk a hpGRF-44 mRNS-t a poli-A -RNS-ből. A 21. jellel jelzett klónból izolált jelzett plazmidot használva hibridizációs próbaként a Northern analízis során, a poli-A+-ríbonukleinsavból, olyan csíkot izolálunk, amely megfelel 820 nukleotidból álló mRNS'nek. Mivel a 21. rekombináns tartalmazza a teljes 3’-nem kódoló szakaszt és a poli-A+-részt, úgy tűnik, hogy a kiónba transzformáit, 520 bázispárból álló cDNA-szegmens nem tartalmazza a preproGRF molekulának megfelelő dezoxi-ribonukleinsav teljes 5’-nem kódoló szakaszát. 9 h A 21. számmal jelzett klón tartalmazza beépült dezoxi-ribonukleinsav szegmensében a teljes GRF-44 kódoló szakaszt, a klónból kapott cDNS így hosszabb, és specifikusabb hibridizációs próbaként használható fel hasonló dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket tartalmazó kiónok izolálására. Az eredeti cDNS bankot ezért újra megvizsgáltuk egy olyan próbával, amely a 21. számmal jelzett klón cDNS beépült szakaszának 5’-végéről származik (lásd az előzőekben ismertetett táblázatban a 82—149. nukleotidokat). Az egyik klón, a 8. számmal jelzett, olyan beépült dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst tartalmaz, amely 5’-végén 40 nukleotiddal hoszszabb, tartalmaz továbbá egy trinukleotidot a kódoló szakaszban, és egy további tetranukleotidot a 3’-nem kódoló szakaszban. Ahogy azt a táblázatból kiderítjük, a trinukleotid egy további szerint ír le (103), a 108 aminosavból álló pepiidben, a preproGRF-108-ban. Az analizált további négy klón közül három a preproGRF-108-at meghatározó nukleotid-szek*venciát tartalmaz, egy pedig a preproGRF-107-et leíró szekvenciát hordoz. Ez azt jelenti, hogy legalább két különböző hpGRF mRNS van jelen. Jelzésekkel rendelkezünk arra vonatkozóan, hogy a 8. jellel jelzett kiónban levő dezoxi- ribonukleinsav-szegmens gyakorlatilag a teljes preproGRF cDNS, ez gyakorlatilag az öszszes GRF-44 mRNS molekulát reprezentálja. További jelzéseink vannak arra vonatkozóan, hogy a hpGRP hírvivő ribonukleinsavának egy kis része 80 nukleotiddal hosszabb. A preproGRF-107 és 108 molekulákat leíró két cDNS primer szerkezetét meghatározva szerkezetére vonatkozóan bizonyos megfigyeléseket tettünk. A preproGRF-107 és a preproGRF-108 első 20 aminosava (a táblázatban aláhúztuk), valószínűleg a hidrofób szignál pepiidet reprezentálja, amely a proGRF-hez kapcsolódik, és 87—88 aminosav hosszúságú. A proGRF-87 és a proGRF-88 hasítási helyeket tartalmaz ( a táblázatban ezeket a helyeket bekereteztük), az enzimes hasítás után létrejön a hpGRF-44. Az amino-terminális vég előtt helyzekedik el két arginin (30—31), míg a karboxil-terminális vég után közvetlenül elhelyezkedő arginin (77) jelenti a másik hasítási helyet. A hpGRF-44 karboxil-terminális leucinját követő glicin -arginin -szekvencia (76—77) jelenti azt a helyet, ahol az érett termék amidálása bekövetkezik. A cDNS bank kiónjai közül a hibridizációs kísérletben pozitív eredményt adókból izolált cDNS-szegmensek felhasználhatók a GRF kifejezésére mind eükarióta, mind pedig prokarióta sejtekben. A 21. és 8. számmal jelzett klónokból kapott plazmid DNS-t használjuk. A plazmidot HindIII endonukleázzal hasítjuk a beépült cDNS fragmens 5’-végének felnyitására. A preproGRF szekvenciának 5’-része Bal31 exonukleázzal hasítható olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmens sorozatok előállítására, ame-10 197939 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
