197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására

197939

lünk, amelyek előreláthatóan komplementerek a természetes GRF gén egy szegmensével, majd ezeket az oligo-dezoxi-nukleotidokat használjuk fel a telepek kiválasztása érdekében végzett hibridizációkor próbaként. Két kevert nukleotid próbát szintetizálunk Miyoshy és munkatársai szerint [Nucleic Acids Res., 8, 5507—5517 (1980)], ezt a szilárd fázisban foszfo-triészteres módszerrel kapott terméket

5

5’-végein P32-ATP-vel jelezzük Maxam és munkatársai szerint [Methods in Enzymology, Grossman és munkatársai szerkesztésében,

65. kötet, 499—560. oldal, Academic Pess, New 5 York (1980)]. Az egyik kevert oligo-dezoxi-nukleotid-próbát A-jel lel jelöljük, ez 20 bázis hosszúságú, és megfelel a hpGRF-szekvencia alábbi 1—7. aminosavának:

6

1 7

H-Tyr-Ala-Asp Ala-Ile- Phe-Thr 5’-ATG CGN CTG/A CGN TAT/G/A AAA TG-3’.

A másik, 14 bázis hosszúságú próbát B-jellel jelöljük, ez megfelel a hGRF 35—39. aminosavának:

35 39

Asn- Gin- Glu- Arg- Gly

5’-TTA/G GTT/C CTT/C GCN vagy TCT/C CC-3’.

(A fentiekben N a négy nukleotid bármelyikét jelentheti).

A B-jelű tetradekamer-próbát a telepek vizsgálatakor Hanahan és 'munkatársai szerint használjuk [Gene, 10, 63—67 (1978)]. A hibridizációt az alábbi összetételű pufferben végezzük:

0,75 mól nátrium-klorid,

0,075 mól nátrium-cjtrát,

0,1 százalék nátrium-dodecil-szulfát,

100 pg/ml részlegesen hidrolizált élesztő ribonukleinsav,

0,2 százalék borjú szérum albumin,

0,2 százalék polivinil-pirrolidon és 0,2 százalék Ficoll.

A reakciót 30°C hőmérsékleten végezzük 2 órán át, 1 pmól jelzett próbát használunk milliliterenként. A szűrőket az alábbi összetételű mosófolyadékban gyorsan kiöblítjük:

0,3 mól nátrium-klorid,

0,03 mól nátrium-citrát.

A mosást szobahőmérsékleten végezzük. Ezután a mosást nagyobb ionkoncentrációjú oldattal ismételjük meg, ennek összetétele:

0,6 mól nátrium-klorid,

0,06 mól nátrium-citrát.

A mosást 60 percen át végezzük 40°C hőmérsékleten, majd a szűrőket X-sugárzásra érzé-3<^ kény filmre helyezzük egy éjszakán át. 11 000 cDNS klón B-próbával való vizsgálata során kiderült, hogy a kiónok közül kilenc beépített dezoxi-ribonukleinsav fragmense hibridizálódik a B-próbához. A kilenc rekombináns közül hét dezoxi-ribonukleinsava a Southern-analízis szerint hibridizálódik az A-próbához is.

Az A- és B-próbához egyaránt hibridizálódó plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó teranszformánsokból izoláljuk a plazmidot, és HindlII enzimmel linearizáljuk, majd Smith láncterminációs módszerével részlegesen szekvenáljuk [Methods of Enzymology, 65, 560—580. oldal], Primerként a B-próbát használjuk. így négy kiónt azonosítunk, ezek

45 hpGRF szekvenciákat határoznak meg, közülük a 21. számmal jelzett tartalmazza a legnagyobb cDNS beépült szakaszt, ennek hossza 520 bázispár.

50 A 21. számmal jelzett klón beépített cDNS részét Maxam és munkatársai (lásd fent) módszerével teljesen szekvenáljuk, és az eredményt az alábbi táblázaton mutatjuk be.

4