197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására
— ezekkel a plazmidokkal E. coli sejteket transzformálunk, — a transzormánsok telepeit a GRF szekvenciának részletével komplementer hibridizációs vizsgáló mintával hibridizálva átvizsgáljuk, — a vizsgáló mintával hibridizálódó telepekből a plazmidot izoláljuk, ezeket a plazmidokat linearizáljuk, és a linearizált plazmidokat a fenti vizsgáló mintával újra átvizsgáljuk — a hibridizáló kiónokat kiválasztjuk, a hibridizáló klónokból a kifejezett termékek aminosav -szekvencia -elemzése alapján a preproGRF aminosav-szekvenciáját magában foglaló kiónokat kiválasztjuk, — és kívánt esetben további kiónok kiválasztásához valamely ilyen kiónt vizsgáló mintaként felhasználva hibridizációs átvizsgáláshoz felhasználjuk, — és bármely, fentiekben nyert kiónból a DNS-t kinyerjük. A találmány szerinti eljárás során a humán növekedési hormont felszabadító prepro hormon faktor izolálása érdekében előállítunk és szekvenálunk géneket, amelyek a humán has nyálmirigy növekedési hormon felszabadító faktor (hpGRF) két prekurzorát határozzák meg. A humán hasnyálmirigy hormont felszabadító faktor 44 aminosavból álló peptid, és hpGRF-44 jellel jelöljük. A hpGRF-44 biológiai, immunológiai és fiziko-kémiai evidenciák szerint azonos a humán hipotalamusz növekedési hormont felszabadító faktorral (hhGRF). A két cDNS egyike 107 aminosavból álló prekurzort ír le, ezt preproGRF-107 jellel jelöljük; a másik, 108 aminosavból álló prekurzort határoz meg, jele: preproGRF-108. A preproGRF molekulák mindegyike tartalmazza a hpGRF teljes aminosav-szekvenciáját, és tartalmaznak az amino-terminális és a karboxil-terminális végen peptid fragmenseket is. Mindegyik terminális peptid tartalmazza azokat az alapjeleket, amelyek szükségesek enzimes eltávolításukhoz. Az érett GRF karboxil-terminális végének amidálását a karboxil-terminális peptid glicin-arginin-szekvenciája szabályozza. A hírvivő ribonukleinsav (mRNA) humán hasnyálmirigy tumorból való izolálását végezzük el először. Ezek a sejtek igen magas humán, pankreatikus növekedési hormon felszabadító aktivitással rendelkeznek. Ezután reverz transzkripcióval előállítjuk az mRNS-ből a cDNS-t. A komplementer dezoxi-ribonukleinsavat (cDNS) olyan plazmidhoz kapcsoljuk, amely E. coli sejtekbe tarnszformáiható, a transzformált sejteket egyenként tenyésztjük, így komplementer dezoxi-ribonukleinsavbankot kozunk létre. A cDNS bankból hibridizációs szűréssel kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek hpGRF-szekvenciát tartalmazó pepiidet meghatározó cDNS molekulával transzformálódtak. A hibridizációt a GRF aminosav-szekvencia egyes részeinek megfelelő oligo-dezoxi-nukleotidokkal végezzük. A plazmid 3 dezoxi-ribonukleinsavból kihasítjuk a hibridizációkor pozitív eredményeket adó kiónok cDNS részét, és szekvenáljuk; amiután bizonyítjuk, hogy az adott nukleotid-szekvencia megfelel a GRF aminosav-szekvenciájának, illetve egy nagyobb prekurzor protein részének. Ezt preproGRF jellel jelöljük. Az izolált komplementer dezoxi-ribonukleinsavak 3’- és 5’-végeiken nem-kódoló szegmenseket is hordoznak. Az izolált komplementer dezoxi-ribonukleinsavak, ha megfelelően épülnek be a szabályozó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensekbe, a transzformált sejtekbe a preproGRF szintézisét határozzák meg. A preproGRF molekulát hasító enzimeket tartalmazó transzformált sejtekből preproGRF molekulát tartalmazó po~ lipeptideket izolálunk és tisztítunk. A preproGRF molekulát hasítani képes enzimekkel rendelkező sejteket az idegen preproGRF komplementer dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó hibrid génekkel transzformálva GRF-et állítunk elő. A következőkben részletesen leírjuk a találmány szerinti eljárást. \ preproGRF molekulát meghatározó mRNS-t izoláljuk, majd szekvenáljuk. Az izolálást hasnyálmirigy tumorból kiindulva kezdjük [lásd Guillemin és munkatársai, mint fent] amelyek magas belső hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító aktivitással rendelkeznek. 15 g folyékony nitrogénben vagy —80°C hőmérsékleten ellátott tumorból 3 pg poIi-A+-ribonukleinsavat izolálunk Chirgwin és munkatársai guanidin-tiocianátos módszerével [Biochemistry, 18, 5294—5295 (1979)], valamint Norgard és munkatársai szerint végzett oligo-dT-cellulózos kromatográfiával [J. Bio!. Chem., 225, 7665—7672 (1980)]. 3 pg poli-A+-ribonukleinsavból 1 pg kétszálú komplementer dezoxi-ribonukleinsavat szintetizálunk Gubler és munkatársai módosított módszerével (Proc. Natl. Sei. USA 1983, 80(14) 4311 —14), amit Okayama és munkatársai írtak le alapjaiban [Mol. Cell. Bioi., 2, 161 —170 (1982)]. A komplementer dezoxi-ribonukleinsavval komplementer dezoxi-ribonukleinsav-bankot állítunk elő. Peacock és munkatársai módszerének [B. B. A., 655, 243—250 (1981)] módosított változatát használjuk. A cDNS molekulát poli-dGTP-vel kapcsoljuk, és poli-dCTP-vel kapcsolt EcoRV restrikciós enzimmel hasított pBR322 plazmidhoz kötjük. A kimer plazmiddal ezután E. coli RR1 sejteket transzformálunk, és a transzformánsokat szilárd halmazállapotú táptalajon szélesztjük ki. fgy 300000 független transzformánst kapunk. \ telepeket ezután vizsgáljuk annak érdekében, hogy kiválaszthassuk azokat, amelyek olyan cDNS-t tartalmaznak, amely a hpGRF-szekvenciát meghatározó génfrakciók előre meghatározott nukleotid-szekvenciájának megfelelő nukleotid-szakaszokat tartalmaznak. Olyan oligo-dezoxi-nukleotidokat szintetizá-4 3 197939 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
