197939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont felszabadító faktort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav vagy prekurzora előállítására
A találmány a preproGRF-nek jelölt, a humán növekedési hormont felszabadító faktor (GRF) eredeti prekurzor peptidjére, a preproGRF-et meghatározó dezoxi-ribonukleinsavra és a preproGRF és a GRF rekombinációs dezoxi-ribonukleinsav technikával való előállítására vonatkozik. Az emlős hipotalamuszban és a hipofízis elülső lebenyében több fontos hormon termelődik, ezek közül az egyik fontos hormon az emlős növekedését elősegítő növekedési hormon (GH). Bebizonyították, hogy a hipofízis által termelt növekedési hormon felszabadulása egy, a hipotalamuszban képződő peptid regulációja alatt áll. Egy idő óta ismeretes, hogy a hipotalamuszban képződő peptid, a szomatosztatin gátolja a növekedési hormon felszabadulását. Ugyanakkor, megalapozott eredmények mutatnak arra, hogy a hipotalamuszban képződő egyik anyag, amit GRF-nek vagy szomatokrininnek neveznek, a szomatosztatinnal ellentétes irányban hat, azaz elősegíti a növekedési hormon felszabadulását a hipofízisből. Bár a GRF általában a hipotalamuszban képződik, más sejtek is termelik, például a hasnyálmirigy tumorsejtek. Tény, hogy az első, teljes mértékben jellemzett GRF-aktivitással rendelkező pepiidet egy humán hasnyálmirigy tumorból izolálták [Guillemin és munkatársai, Science, 218, 585—587 (1982)]. Valószínű, hogy a humán hasnyálmirigy GRF azonos a humán hipotalamusz GRF-jével, bár ez még nem bizonyított. Mindenesetre a pankreázból származó GRF igen aktívan elősegíti a növekedési hormon felszabadulását, és a humán szervezet növekedésének regulálása szempontjából igen előnyös lenne jelentős mennyiségű pankreázból származó humán GRF előállítása A Guillemin és munkatársai által jellemzett GRF 44 aminosavbó! áll, karboxilcsoportot hordozó végén pedig amidálva van. Ugyancsak leírtak egy olyan GRF molekulát, amely csak 40 aminosavból áll, biológiailag aktívnak találtak ugyanakkor egy mindössze 27 aminosavból álló GRF fragmenst is, bár ez utóbbi kevésbé aktív, mint a 44 aminosavat tartalmazó peptid. A 44 aminosavból álló hasnyálmirigy eredetű GRF peptidet kémiailag szintetizálták, és ez a szintetikus GRF, a szintetikus GRF-fragmensek és szintetikus analógjaik potenciális szabályozó anyagokat reprezentálnak. Ugyanakkor ilyen hoszúságú peptidláncok kémiai szintézise igen költséges. Az olcsó GRF előállításának legreményteljesebb módja valószínűleg az a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technika, amellyel a humán GRF dezoxi-ribonukleinsavat sejtbe juttatjuk, és ott kifejezzük. A GRF molekulát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav előállításának egyik módja az, hogy visszafelé olvasva meghatározzák a genetikai kódot, majd olyan oligo-dezoxi-nukleotidot szintetizálunk, amely leírja a GRF aminosav-szekvenciáját (lásd 4293652 sz. USA szabadalmi leírást). Ilyen 2 1 szintetikus géneket vagy dezoxi-ribonkuleinsavat leírtak. Ezen szintetikus gének bejuttatása sejtekbe mindeddig azonban nem eredményezett olyan transzformánsokat, amelyek jelentős mennyiségű GRF-et termelnek. A génkifejeződés szempontjából jobb eredményeket kapunk a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiával, ha természetes forrásból izolált dezoxi-ribonukleinsavat használunk az aminosav-szekvenciából meghatározott nukleotid-szekvencia alapján szintetizált olígo-dezoxi-nukleotidok helyett. Ennek egyik oka az lehet, hogy — bár a genetikai kód redundáns (degenerált) abból a szempontból, hogy egyetlen aminosavat általában több kodon — három egymást követő nukleotid adott sorrendje — határozhat meg, a természetes nukleotid-szekvencia egy adott kodon szelekciója miatt előnyösebb. Továbbá gyakran megfigyelték, hogy a természetes gén nemcsak az izolált peptidet határozza meg, de leír olyan prekurzor molekulát, amely egy feltételezhető szignáljelet és más, meghatározó és kódoló szekvenciát is meghatároz, amelynek később az érett és aktív peptid termeléséhez szükséges lépések során módosulnak. A találmány kivitelezése során izoláljuk a GRF molekulát meghatározó mRNS-t, és ezt felhasználjuk reakombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákat alkalmazva a GRF előállítására. Ahogy azt a későbbiekben részletesebben leírjuk, az izolált mRNS molekula olyan prekurzor GRF molekulát határoz meg, amely, tartalmazza a humán hasnyálmirigy eredetű GRF-teljes 44 aminosavból álló szekvenciáját, és hordozza a karboxil-terminális és amino-terminális szekvenciákat is. Humán GRF molekulát termelő hasnyálmirigy tumorból előállított ribonukleinsavból kiindulva reverz transzkripcióval cDNS molekulát készítünk, és a GRF-et meghatározó cDNS kiónokat cDNS klónbankbó! azonosítjuk. AcDNS kiónok szekvenálásával bizonyítjuk, hogy ezek a humán GRF molekula két, szorosan rokon prekurzor molekuláját határozzák meg. Mindegyik GRF prekurzor tartalmazza a humán hasnyálmirigy GRF 44 aminosavból álló teljes szekvenciáját, és tartalmazza azt a szignáljelet is, amely szükséges a prekurzor GRF-vé alakulásához, tartalmazza a karboxil-terminális végen az amidált csoportot is. A cDNS kiónokkal sejteket transzformálunk, és a transzformált sejtekből kimutatjuk a GRF prekurzorok közvetlen szintézisét. Ha a transzformált sejtekben jelen vannak az átalakító enzimek, a prekurzor GRF molekulává alakul. A találmány szerint úgy járunk el, hogy — GRF-et tartalmazó humán hasnyálmirigy szövetből mRNS-t, majd ennek dúsításával poli-A+ mRNS-t izolálunk, — ebből komplementer DNS-t (cDNS) szintetizálunk, és a cDNS-eket valamely plazmidba beépítjük, 2 197939 5 10 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 65
