197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
7 197938 focitákat inokuláljuk 1 ml RPMI 1640-ben lXl06/ml sejt-sűrűséggel 24 üreges Nunc tenyésztő lemezen 10 pg/ml PHA jelenlétében és 24 órán át tenyésztjük 37°C hőmérsékleten 7,5% C02-inkubátorban. A tenyészet felülúszóját kinyerjük, centrifugáljuk, 0,22 p millipórusú szűrőn átszűrjük és IL-2 aktivitásra megvizsgáljuk, hogy pontosan meghatározzuk az IL-2 termelő normál humán T-limfocita kiónokat. (3) Mitogén jelenlétében IL-2-t termelni képes humán limfocitákból származó rosszindulatú sejtvonal nyerése Jurkat sejtvonal, vagy klónozott sejtvonalak, mint pl. Jurkat 111, amelyet a fentebb leírt korlátozott hígításos módszerrel nyertünk, képesek 10—4 000 egység/ml IL-2-t előállítani, amikor 24 órán át tenyésztjük a korábban leírt szérum-mentes szintetikus tápközegen vagy 1—2% emlős szérumot tartalmazó RPMl-1640-en, mitogén, mint pl. 10 pg/ml Con A vagy 2,5 pg/ml PHA jelenlétében. Ezek a rosszindulatú humán sejtvonalak termelnek IL-2-t akkor is, amikor cink-klorid, „A“ fehérje vagy picibanil jelenlétében tenyésztjük. (4) Mitogén, más stimuláló sejtek vagy stimuláló oldható faktorok együttes jelenlétében IL-2-t termelni képes sejtek nyerése Molt 4 F humán rosszindulatú sejtvonal és bizonyos klónozott sejtvonalak, mint pl. Jurkat J 99 — amelyet a korlátozott hígításos módszerrel nyertünk — nem termelnek IL-2-t még akkor sem, ha 24—72 órán át lektin vagy mitogének bármilyen koncentrációja jelenlétében tenyésztjük. Ugyanakkor ezek a sejtek képessé válnak jelentős mennyiségű (10—100 E/ml) IL-2-t termelni 24 órás .tenyésztési időköz alatt 37°C hőmérsékleten, ha együtt tenyésztjük 5—10 E/ml interleukin 1 -el (a monokinek egyikével), vagy K 562 vagy Raji sejtek 50%-ot kitevő mennyiségével. Az IL-2 mRNS kivonását a fentebb említett módon aktivált sejtekből a hagyományos, jól ismert módszerrel végezzük, tekintet nélkül a sejtek különböző forrásaira. így pl. a sejteket részben vagy teljesen felaprítjuk detergens, pl. NP-40, SDS, Triton X és dezoxi-kólsav hozzáadásával vagy mechanikai homogenizálással vagy a fagyasztás-felengedtetés módszerével. Hogy az mRNS kivonása folyamán az RNS ribonukleáz által okozott bomlását megakadályozzuk, előnyös RN-áz inhibitorokat, mint pl. heparint, polivinil-szulfátot, bentonitot, makaloidot (forgalmazza: National Lead Company, Houston, Texas) dietil-pirokarbonátot vagy vanadil-komplexet hozzáadni. Az IL-2 mRNS-t az IL-2 bioszintézisében kicsapott poliszómából nyerhetjük, amely anti-IL-2 antitesttel van kicsapva egy detergenssel kivonva. A poli A-t tartalmazó mRNS-t bármilyen hagyományos módszerrel lehet frakcionálni vagy koncentrálni, így pl. affinitás-kromatográfiával, vagy oligo-dT cellulózon vagy sepharose 2 B poli-U-sepharózán történő egytételü abszorpcióval, szacharóz sűrűség gradiens centrifugálással vagy agaróz gél elektroforézissel. Az mRNS frakciókat ezután levizsgáljuk IL-2 mRNS aktivitásra az mRNS frakciókból átírt fehérjék biológiai aktivitásának kipróbálásával vagy az átírt fehérjék azonosításával, az IL-2 pepiid elleni mon'oklonális antitestet alkalmazva. így pl. az mRNS általában a megfelelő fehérjévé íródik át, béka (Xenopus laevis) petébe történő mikroinjekcióval (Gurdon, J. B. és munkatársai: Nature 233, 177—182 (1972)), vagy az mRNS-től függő ‘retikulolizátumnak vagy gabonacsíra transzlációs, sejtmentes rendszerének alkalmazásával. Az IL-2 aktivitást lehet bizonyítani mikrovizsgáló módszerrel, amelyet elvileg Gillis és munkatársai (Gillis, S. és munkatársai: J. Immunoi., 120,2027—2033 (1978)) dolgoztak ki. A vizsgálat figyeli a citotoxikus T limfocita sejtvonalak (CTLL) IL-2 függő celluláris sejtburjánzását, a sejtvonalak Gillis és munkatársai által leírt módszer szerint vannak kiváltva. Azaz 4X103 CTLL sejtet inokulálunk 2% FCS-t tartalmazó 100 pl RPMI 1640 tápközegbe 96 üreges laposfenekű mikrolemezben 100 pl sorozatban hígított átírt termékkel együtt. 20 óra inkubálás után 37°C hőmérsékleten 5% C02 inkubátorban a sejteket 4 órán át rázatjuk 0,5 pCi 3H-TdR-rel, üvegszál-csíkokra gyűjtjük ki egy automatikus sejtkinyerő segítségével, majd a beépült aktivitást folyadék scíntil 1 ációs számlálóval mérjük. Ezekkel a vizsgáló eljárásokkal az IL-2 jelenlétében tenyésztett CTLL sejtekről úgy találjuk, hogy a 3H-TdR dózis-függő módon beépül, a vizsgálati mintában levő IL-2 mennyiségének határozott kiszámítását téve lehetővé. Az IL-2 olyan aktivitással rendelkezik, amely a T-limfociták burjánzását elősegíti, ez lehetővé teszi az IL-2 aktivitás mérését T-sejt növekedési aktivitási indexet alkalmazva. Azaz 5 CTLL sejtet viszünk át 100 pl 2% FCS-t tartalmazó DMEM-be 96 üreges laposfenekű mikrolemezekben 100 pl széria-higításos átírási (transzlációs) termékkel együtt. 72—96 órás inkubálás után 37°C hőmérsékleten 5% C02 inkubátorban, a kinőtt sejtek és aktivált sejtek számát mikroszkóp alatt megszámoljuk. Pozitív külső kontroll csoportként 100 egység/ml és 10 egység/ml IL-2-t adunk és a vizsgálati minta IL-2 aktivitását kiszámítjuk, összehasonlítva a kinőtt élő sejtek számával ezekben a kontroll csoportokban. A legaktívabb frakciókból így nyert IL-2 mRNS szolgál templátként a ds-cDNS szintéziséhez és a ds-cDNS kapcsolódik egy vektor DNS-sel. A cDNS szintézisét hagyományos módszerekkel hajtják végre. Először ss-cDNS, amely az mRNS-sel komplementer, készül el dATP, dGTP, dCTP, 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
