197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 dTTP jelenlétében, reverz transzkriptázt al kalmazva és mRNS-t használva templátként, és az oligo-dT-t leolvasó mintaként (primerként). A templát mRNS-t azután alkálikus kezeléssel eltávolítjuk és a ds-cDNS-t reverz transzkriptáz vagy DNS polimeráz alkalmazásával hozzuk létre, a fentebb szintetizált ss-cDNS-t használva templátként. A rekombináns technikával előállított DNS-t az így nyert ds-cDNS-ből és egy replikont tartalmazó vektor DNS-ből — amely replikon képes replikálódni eukarióta vagy prokarióta rendszerekben — készítjük. A rekombináns DNS-t ezután beépítjük a gazdasejtbe. A ds-cDNS és egy vektor DNS, amely képes az eukarióta vagy prokarióta sejtekben sokszorozódni, a kapcsolás előtt módosítva vannak különböző eljárásokkal mint pl. exonukleáz kezelés, kémiailag szintetikus DNS darabok valamint G, C végződés hozzáadása kapcsolható terminálist adva a ds-CDNS és a vektor DNS végeinél. A kapcsolható DNS-ek kapcsolását végre lehet hajtani pl. T4-fág DNS ligáz segítségével ATP jelenlétében. Az így nyert rekombináns DNS-sel élő sejteket lehet transzformálni a klónozott cDNS kibővítésére vagy IL-2 polipeptid termelésére'. Megfelelő eukarióta gazda-organizmusok, amelyeket általában IL-2 termelésére használnak, lehetnek gerincesek, élesztők stb. így pl. majom-sejteket, (pl. CV-1 sejt), amelyeket SV-40 eredet-deíektív mutánssal transzformálták és amely az SV-40 nagy T antigénjét (COS sejtek) fejezi ki, amint ezt Y. Gluzman részletezte (Cell, 23, 175—182 (1981)); egéreredetű sejteket, amelyeket Ohno, S. és Taniguchi, T. írtak le (Nucleic Acids Research, 10, 967—977 (1982)); és élesztő gazda-vektor rendszereket, amelyeket az IFN gén kifejezéséhez alkalmaznak, és amelyet R. Hitzeman írt le (Nature, 293, 717—722 (1981)), lehet használni. Megfelelő prokarióta gazda-organizmusok lehetnek Escherichia, coli, Bacillus subtilis, stb. A DNS sokszorozása érdekében a gazdaszervezetben előnyös az E. coli-t alkalmazni gazdaszervezetként, bár más gazdaszervezetek is alkalmazhatók. Az E. coli-hoz használt alkalmas vektorok lehetnek EK típusú plazmid vektorok (szigorú típus): pSCIOl, pRK353, pRK646, pRK248, pDF41, stb; EK típusú plazmid vektorok (mérsékelt típus): Col El, pVH51, pAC105, RSF 2124, pCR 1, pMB9, pBR313, pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, pKY2289, pKY2700, pKN80, pKC7, pKB158, pMK2004, pACYCl, pACY184, dúl, stb; A gt típusú fág vektorok A gt.Ac, A gt.AB, AWES, AC, AB. Azj vir., AB’, AALO, AB, AWES.Ts622, ADam, stb. Általában a pBR322-t használják leggyakrabban vektorként E. coli-hoz és ebben az esetben a legjobb klónozó helyek a Pstl és az EcoRI helyek. 9 6 A gazdasejt transzformálását a rekombináns DNS-sel hagyományos úton lehet végrehajtani a következőképpen. Ahol a gazdaszervezet prokarióta, mint pl. az E coli, olyan megfelelő sejteket készítünk, amelyek képesek a DNS befogására. Ezeket a sejteket olyan sejtekből készítjük, amelyeket az exponenciális növekedési fázis után nyerünk és ezt követően CaCl2-módszerrel, ismert eljárás szerint kezelünk. Amikor MgCl2 vagy RbCl van a transzformációs reakcióközegben, a transzformáció hatásfoka nő. A transzformációt a gazdasejtből történt protoplaszt-képzés után is végrehajthatjuk. Ahol az alkalmazott gazdaszervezet eukarióta, a DNS transzfekciós módszerét, mint pl. kalcium-foszfátos kicsapást, hagyományos mechanikus módszereket, mint pl. mikroinjektálást, a vörös vérsejt gazdaszervezetben vagy liposzómákban bezárt plazmid beiktatását, a sejtek kezelését valamilyek ágenssel, mint pl. lizoíoszfatidil-kolinnal, vagy vírus vektorok alkalmazását és más hasonló módszereket lehet használni. Az IL-2 génnel rendelkező sejtek izolálása a transzformáció után az alábbi két módszer egyikévei történhet: (1) A plusz-mínusz módszerben, részlegesen tisztított IL-2 mRNS-t nyerünk a mitogénnel aktivált emlős sejtekből extrahált mRNS-ek szacharóz gradiens centrifugálásával, mint 11 — 12S üledékeket, majd 32 P-radioaktívan jelzett ss-cDNS-t szintetizálunk a részlegesen tisztított mRNS-t használva templátként. A templát mRNS alkálikus kezeléssel történő eltávolítása után az izolált cDNS-t hidroxilapatit-oszlopkromatográfiával frakcionáljuk. A nem hibridizált cDNS-t és a hibridizált cDNS-t ideiglenesen „A“ mintának, illetve „B“ mintának nevezzük. A transzformánsok a két nitrocellulóz szűrőn teljesen azonos módon nőnek, és a sejtek DNS-e a szűrőpapíron alkálikus kezeléssel rögződik. Az „A“ mintát és a „B“ mintát hibridizáljuk a DNS-sel két különböző szűrőpapíron, majd autoradiográfiás mérést hajtunk végre, hogy kiválaszszuk azokat a transzformánsokat, amelyek pozitívan reagálnak az „A“ mintával (plusz), de gyengén vagy egyáltalán nem reagálnak a „B“ mintával (mínusz) (Taniguchi és munkatársai: Proc. Jpn. Acad., v 155B 464—469 (1979)). (2) A második módszer pl. 1000—10000 transzformáns klón szétosztásából áll több tíz vagy több száz klóncsoportba. A szétosztott klóncsoportokat egymás után tenyésztjük hagyományos módon, hogy plazmid DNS-t nyerjünk. Ezután ezeket a plazmid DNS-eket átalakítjuk ss-cDNS-ekké, pl. hődenaturálással, és a nyert ss-cDNS-eket nitrocellulóz szűrőpapíron rögzítjük, hogy a rögzített DNS- re komplementer és aktivált IL-2 mRNS-t magába foglaló emlős sejtekből készült mRNS hibridizálását elérjük. Egy másik módszer szerint IL-2 mRNS-t tartalmazó mRNS-t hib-1Ö 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
