197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 az mRNS képződés kiváltásához a tenyésztett sejteket megfelelő tápközeggel mosni kell, majd a megfelelő tápközegben fel kell szuszpendálni, ilyen tápközeg pl. a Rosewell Park Memorial Institute 1640 (a továbbiakban „RPMI 1640“), a Dulbecco Modified Eagle Medium (a továbbiakban „DMEM“) vagy olyan Click-féle tápközeg, amely szérumot tartalmaz vagy nem tartalmaz. Ezek a tápközegek ki lehetnek egészítve különböző adalékanyagokkal, mint pl. penicillinnel, streptomicinnel vagy más antibiotikumokkal, vagy friss L-glutaminnal, HEPES pufferral és nátrium-bikarbonáttal olyan koncentrációban, amelyet a sejttenyésztés területén általában használnak. Az előnyös sejtsűrűség 0,5—4-106 sejt/ml lehet. Az mRNS és az IL-2-előállítás aktiválásának indukálása érdekében megfelelő stimulánsokat adunk hozzá. Ilyen megfelelő stimulánsok lehetnek a mitogének, neuraminidáz, galaktóz-oxidáz, cinkszármazékok, mint pl. cinkklorid, vagy mikroorganizmusokból származó limfocita aktiváló anyagok, pl. „A“ fehérje, O-streptolizin. A stimulált sejteket kinyerjük és mossuk. A mitogén-stimulálás folyamán szintén jelenlevő makrofágok vagy dendrites sejtek szintén aktiválhatják az mRNS-t, vagy növelhetik az aktivált mRNS mennyiségét. Hasonlóképpen a B limfocitákból vagy B limfocita vonalakból — mint pl. Raji, Daudi, K 562 és BALL-1 — származó sejtvonalak egyidejű jelenléte aktiválhatja az mRNS-t vagy növelheti az aktivált mRNS mennyiségét. Az emlős sejtek sokszorozódásának érdekében ezeket in vitro sejt-tenyészetben kell fenntartani, vagy szövettanilag összeférhetően kiválasztott állatokban normál körülmények között. Amikor in vitro tenyészet fenntartását alkalmazzuk az mRNS forrás készítéséhez, a sejteket lehet növeszteni bármilyen olyan tenyésztő tápközegen, amelyről korábban úgy találtuk, hogy elősegítik a T sejtek növekedését. Ezek a tápközegek ki lehetnek egészítve (vagy nincsenek kiegészítve) emlős szérummal, szérumkomponensekkel vagy szérum albuminnal. Az mRNS aktiválásához szükséges időtartam megfelel annak az időtartamnak, amely a sejtek aktiválásához szükséges, hogy kiváltsák az mRNS képződését. Ez az időtartam általában egybeesik azzal az idővel, amely ahhoz szükséges, hogy az IL-2 kiválasztása a tápközegben meginduljon. Az előnyös időtartam 3—12 óra között lehet a stimuláns, mint pl. egy nitrogén hozzáadása után. A tenyésztési időtartam indokolatlan meghosszabítása alkalmanként a kialakult mRNS elbomlását eredményezheti. Az IL-2-t termelő sejtek aktiválási folyamata során forbol-észtereket, mint pl. PMA-t vagy TPA-t lehet előnyösen alkalmazni 10—50 ng/ml koncentrációban, hogy emeljük az aktiválás szintjét. Az IL-2 mRNS aktiválásának fentebb leírt folyamata 32—38°C hőmérsékleten, párásított 5 4 atmoszférában, mintegy 7,0—7,4 pH értékben hajtható végre. Azokat az eljárásokat, amelyek az IL-2 termelésére képes emlős sejtek tenyésztéséhez és kinyeréséhez szükségesek, az alábbiakban magyarázzuk el részletesebben. (1) Konstitutív IL-2 termelő sejtvonalak nyerése Humán leukémia T-sejt Jurkat-sejtvonalát (amely szabadon beszerezhető a következő helyekről: Fred Hutchinson Cancer Institute, Seattle, Egyesült Államok, Salk Institute, San Diego, Egyesült Államok; Német Rák-központ, Heidelberg, Nyugat-Németország) szuszpendáljuk Click-tápközegben 1X10® sejt/ml sejtsűrűséggel és 8X103 R röntgensugárral sugározzuk be 150 R/perc besugárzási sebességgel. Ezután az így besugárzott sejtekből 0,1 sejt/ /200 pl tápközeg koncentrációban 5% FCS-t tartalmazó Click-tápközeget inokulálunk 96 üreges laposfenekű mikrolemezben (Falcon 3072) és 3 héten át tenyésztjük 37°C hőmérsékleten 5% széndioxidot tartalmazó inkubátorban (klónozás korlátozott hígításos módszerrel) . A kinőtt elő sejteket átvisszük 24 üreges tenyésztő lemezre (Nunc), még mielőtt a sejt-réteg egybefolyóvá válna, majd további 5 napig tenyésztjük. A kinőtt sejteket tovább tenyésztjük szérumban és szérum-albumin mentes szintetikus tápközegben mintegy két napig 1—2X106/ml kezdeti sejtsűrűséggel. A tenyészet felülúszóját centrifugálással kinyerjük, és 0,22 millipórusú szűrőpapíron átszűrjük, hogy az üledéktől megtisztítsuk és a felülúszót sterilezzük, majd a konstitutiven IL-2 termelésre képes, röntgensugárral kezelt mutánsokat kiválasztjuk és klónozzuk a felülúszóban mért IL-2 aktivitás mérése alapján. (2) IL-2 termelő sejt kinyerése humán perifériás vér mononukleáris sejtekből. Humán perifériás vért nyerünk ki és perifériás vér limfocitákat (a továbbiakban „PBL“ izolálunk sűrűség gradiens centrifugálással Ficoll-Hypaque-on. A PBL-t 2 ml 5% FCS-t tartalmazó Click tápközeg 2 ml-ében inokuláljuk lXl06/ml sejtsűrűséggel 24 üreges Nunc tenyésztő lemezen 100 pl 5 mg/ml-es fitohemaglutinin M-el (Gibco) (pHA) együtt, és 48 órán át tenyésztjük a fentebb leírt körülmények között. A sejteket mossuk és ismét inokuláljuk 1 ml Click tápközegben 1X105 ml sejtsűrűséggel 1 ml „kondicionált“ tápközeggel együtt — amely tápközeg olyan humán splenocitákból készült, amelyeket 2,5 pg/ml concanavalin A-val („Con A“) stimuláltak 48 órán át —, majd az 50% „kondicionált“ tápközeget tartalmazó tápközeget három naponként cseréljük, hogy a PBL-ből humán T limfociták hosszú idejű tenyészetét nyerjük. Az így készített hosszú ideig tenyésztett humán T limfocitákat klónozzuk a fentebb leírt korlátozott hígitásos módszerrel humán splenocita eredetű „kondicionált“ tápközeg jelenlétében és a sejt kiónokat hasonlóképpen sokszorozzuk. Ezután a klónozott humán T lim-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
