197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 peptidet kódoló gént magában Foglalja, valamint egy vektor DNS-t is foglal magában, amely képes replikálódni egy prokarióta vagy eukarióta sejtben; az említett gén kódoló szekvenciája a promotor szekvenciától lefelé helyezkedik el. A jelen találmány prokarióta vagy eukarióta sejtvonalakat is mutat be, amelyeket a fentebb említett DNS-sel, vektor DNS-sel és kódoló génnel transzformálva IL-2 termelésére tettek képessé. A vektor DNS képes replikálódni a sejtben; az említett gén kódoló szekvenciája a promotor szekvenciától lefelé helyezkedik el. A jelen találmány szerint IL-2 állítható elő olyan eukarióta vagy prokarióta sejtvonalat tartalmazó tápközeg aerob tenyésztésével, amely IL-2 termelése érdekében transzformálva van. A transzformáció egy olyan DNS-sel történik, amely rekombináns technikával módosítva van egyrészt az IL-2 aktivitásával rendelkező polipeptidek előállítását kódoló, találmány szerinti génnel, másrészt egy a sejtben replikálódni képes vektor DNS beiktatásával; az említett gén kódoló szekvenciája a promotor szekvenciától lefelé helyezkedik el. A találmánynak és előnyeinek sokkal teljesebb felbecsülése válik lehetővé és az egész találmány jobban megérthetővé válik az ezt követő részletes leírásban, ha a kísérő rajzokkal kapcsolatban néhány magyarázatot adunk. Az 1. ábra az IL-2 aktivitásával rendelkező polipeptid (a továbbiakban ezt „IL-2 polipeptid“-nek nevezzük) termelését kódoló klónozott gén restrikciós endonukleáz hasítási térképét mutatja be. A 2(a) ábra a klónozott gén bázis-szekvenciáját mutatja be. A 2(b) ábra mutatja be az IL-2 aktivitást mutató polipeptidek I. Aminosav szekvenciáját, II. Aminosav-szekvenciáját és III. Aminosav-szekvenciáját. A 3. ábra a rekombináns DNS (pCEIL-2) konstrukcióját bemutató folyamatábra, a rekombináns DNS-be a kódoló gén lett beiktatva. A 4. ábra a pTrs-3 plazmid vektort mutatja be. Az 5(a), 5(b) és 5(c) ábrák a pTIL 2—22, pTIL 2—21, pTIL 2—14 és pTIL 2—15 rekombináns DNS-ek konstrukcióját bemutató folyamatábrák, vektorként pTrs-3-at használva. A 6. ábra a pKIL 2—21 rekombináns DNS konstrukcióját bemutató folyamatábra, vektorként pKT -218-at használva. A 7. ábra a pTuIL 2—22 rekombináns DNS konstrukcióját mutatja be folyamatábrában. A 8. ábra bemutatja azokat a DNS-eket, amelyek képesek replikálódni Saccharomyces cerevisiae sejtben. Az ábrákban az „A“, „G“, „C“, és “T“ dezoxiadenilsavat, dezoxiguanilsavat, dezoxicitidil-savat és timidilsavat jelentenek. A továbbiakban röviden ismertetjük a találmány előnyös megvalósulási módját. 3 Egy IL-2 polipeptidet kódoló klónozott gént lehet nyerni az IL-2-nek megfelelő (IL-2 mRNS) és IL-2 aktivitással rendelkező polipeptidet előállítani képes emlős sejtből eredő messenger RNS (mRNS, „RNS“ a ribonukleinsav rövidítése) átírásával komplementer DNS-sé (cDNS). A nyert egyszálú cDNS (ss-cDNS) átalakítható kettős szálú cDNS-sé (ds-cDNS). A cDNS előállításához templátként használt mRNS-t hagyományos módon lehet elkülöníteni az IL-2 polipeptid termelésére képes emlős sejtből. Az elkülönített RNS poliadenilált (Gillis és munkatársai: Immunological Rew., 63, 167—209 (1982)), és a poliadenilált RNS-t frakcionálni lehet pl. szacharózsűrűség gradiens centrifugálással, mint 11 — 12 S üledéket. 13 S mRNS alkalmi előfordulása is mutat mRNS aktivitást, és ilyen esetekben az látszik valószínűnek, hogy ez az mRNS a 11 —12 S mRNS egy aggregált formája. Az IL-2 termelésére képes emlős sejt, amely a jelen találmány szerinti mRNS forrása, lehet T-limfocita, mint pl. perifériás vér mononukleáris sejtek, mandula sejtek, lépsejtek és hasonlók, amelyek operációs úton nyerhetők az emlősökből. A sejteket hagyományos módon lehet előkezelni, mint pl. nylon oszloppal, antiszérum-komplementtel, sűrűség-gradiens centrifugálással, többszöri enzimes kezeléssel, mint pl. neuramidináz és galaktóz-oxidáz kombinációja, röntgen-sugár besugárzással vagy tripszinnel, hogy a sejteket felruházzuk IL-2 termelőképességgel vagy, hogy növeljük az IL-2 aktivitást. T sejt növekedési faktor jelenlétében történt tenyésztés után az említett emlős sejtekből nyert klónozott T limfociták szintén használhatók mRNS forrásként, és ezek az előnyös limfociták. Transzformált limfocita sejtvonalak, mint pl. leukémia vagy limfóma sejtvonalakból, vagy a fentebb említett módszerekkel elvégzett mutációval vagy előkezeléssel nyert származékaiból származó T limfociták, vagy a klónozott transzformált sejtvonalak előnyösek mRNS forrásként. Nyilvánvaló, hogy a klónozott sejtvonalak általában nagyobb mennyiségű IL-2 mRNS-t tartalmaznak, mint az eredeti sejtvonal-tömeg. A fentebb említett sejtekből származó limfociták és tumor sejtvonalak (pl. CEM, Molt 4 F és BW 5147) egyesítéséből nyert T-sejt hibridómák szintén előnyös sejtvonalak a találmány szerinti módszerhez. A sejtvonalból származó limfociták között lehetnek olyanok, amelyek (1) konstitutív IL-2 termelőkés olyanok, amelyek (2) IL-2-t csak akkor termelnek, ha a tenyészetben kívülről beadagolt mitogén van jelen, vagy ha egyéb IL-2 termelést befolyásoló sejtek vannak jelen, vagy vannak távol. Abból a célból, hogy IL-2 mRNS-képződést váltsunk ki a konstitutív IL-2 termelő sejtekben, a konstitutív IL-2 termelő sejteket a sejttenyésztés területén általánosan ismert körülmények között tenyésztjük. Az IL-2-t csak mitogén jelenlétében termelő sejtekben 4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
