197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 szuszpendálunk 0,5 ml 5% FCS-t tartalmazó DMEM tápközegben, 24 üreges tenyésztő lemezben (Nunc) és 4 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten. Ez után 1 pg fentebb leírt vektor, 17,6 pl 1 mmól/literes, 0,1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó Tris-HCl, 2,4 pl 2 mól/literes CaCl2 és 120 pl 2xHBS (amely 50 mmól/liter Pipes-t, 280 mmól/liter NaCl-t és 1,5 mmól/liter Na2HP04pXl2H20-t tartalmaz) (pH 7,10) keverékét adjuk hozzá a tenyésztett sejtekhez. A sejteket tovább inkubáljuk 4 órán át, 37°C hőmérsékleten, és a tápközeget leszívjuk, 1 ml PBS-sel mossuk, majd 0,5 ml 20% glicerint tartalmazó PBS-t adunk hozzá, szobahőmérsékleten hagyva 3 percen át. A tápközeget ismét leszívjuk és a 29 sejteket 1 ml PBS-sel mossuk, és 1 ml, 5% FCS-t tartalmazó DMEM-ben tenyésztjük. Minden 24 órában 500 pl tápközeget kicserélünk friss tápközegre. Minden egyes tápköze- 5 get, amelyet a megfelelő időközönként összegyűjtöttünk, 4°C hőmérsékleten tartunk felhasználásig. Az átvitel (transzfekció) után 2—3 nappal a tenyésztett sejt tápközeget IL-2 aktivitásra megvizsgáljuk. Amint a 3. Tábláid zat mutatja, az eljárás eredményeként létrejött tenyészet felülúszója — a tenyészet az átvitt PCEIL-2-t tartalmazó COS-7 sejt — tartalmaz IL-2 aktivitást. IL-2 aktivitás nem volt kimutatható az átvitt pCE-l-et tartalmazó 15 sejtek tápközegében. 30 DBS, amelynek átvitele /transzfekció ja/ megtörtént 3. Táblázat IL-2 aktivitás 5K-TdR befogadással mérve /egység/ml/ 1-limf oc ita növekedé s pCEIL-2 P C E-1 12 ++-H-1 A tenyészet tápközegében talált IL-2 aktivitás a COS-7-be történt pCEIL-2 átvitel (transzfekció) után semlegesíthető 12 egység/ml — 1 egység/ml egér (BALB) c) antihumán IL-2 monoklonális antitesttel. Az az 4Q eredmény, hogy a pCEIL-2 átvitele után a COS-7 sejt humán IL-2-t választ ki, világosan mutatja, hogy egy IL-2 polipeptidet kódoló gént és egy, az említett sejtben replikálódni képes vektor DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformált eukarióta sejt határozottan alkalmazható az IL-2 előállítására. Az E. coli HB101-ben beépült pCEIL-2 (AJ 12008) plazmidot letétbe helyeztük FERM 59 -BP244 bevételi számon. 3. Példa Az 1. példában elkészített Escherichia coli K 1776 pIL-2-50A (AJ 11996 (FERM-BP-226)) törzset inokuláljuk 250 ml, 100 pg/ml gg diamino-pimelinsavat, 50 pg/ml timidint, 1% triptofánt, 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% NaCl-t és 0,1% glükózt tartalmazó L-tápközegben, és rázás közben tenyésztjük 37°C hőmérsékleten, amíg a tenyésztő tápközeg optikai sűrűsége 562 nm-en 0,5 lesz. A tenyésztés leállítása 60 után a tenyésztő tápközeget 0°C hőmérsékleten 30 percig állni hagyjuk, és a sejteket centrifugálással kinyerjük, egyszer mossuk 20 mmól/liter Tris-HCl-lel (amely 30 mmól/liter NaCl-t tartalmaz) és újra szuszpendál- 65 juk 1,8 ml ugyanilyen összetételű pufferban. 0,2 pl/ml-es lizozim-oldatból és 20 pl 0,5 mól/ /literes EDTA-ból álló oldatot adunk ez után a sejtekhez és a keveréket állni hagyjuk 0°C hőmérsékleten 20 percen át, ezt követően háromszor egymás után fagyasztás-felengedési folyamatnak vetjük alá. A sejtek extraktumát (1,5 ml) nyerjük ki 40 000 ford/perccel végzett 30 perces centrifugálás után. Az extraktumot kisózásnak vetjük alá 85% ammónium-szulfáttal, Sephadex G15-ön eltávolítjuk a sókat, majd DEAE cellulóz oszlopkromatográfiát alkalmazunk és a 0,06 mól/liter Tris-HCl pufferral (pH 7,6) eluált frakciókat fagyasztva szárítjuk és ellenőrzött pórusú üvegágy (250 A, Funakoshi Pharmaceuticals, Japán) kromatográfiának vetjük alá, így kapva meg a 0,3 mól/liter glicin-HCl pufferral eluált frakciókban az IL-2 aktivitást, ahol az IL-2-t tartalmazó frakció 12 egység/ml IL-2 aktivitást fejt ki. Az eredmények világosan jelzik, hogy az E. coli K 1776 pIL2-50A, AJ 11996 ténylegesen termel IL-2-t. 4. Példa J-A 1886 (ATCC CRL 8130) konstitutív IL-2 termelő sejtvonalat, amelyet az 1. példában leírt módon Jurkat sejtekből klónoztunk, hasonlóképpen hengeres tenyésztőpalackban növesztünk. A kinőtt sejteket újra szuszpendáljuk RITC—55-9 friss szintetikus tápközegben 1X106 sejt/ml induló sejtsűrűséggel, és 16
