197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 8 órával a tenyésztés megkezdése után a sejteket az IL-2 mRNS extrakciójához használjuk fel, 11-12S frakcióként 3pl09 sejtből, az 1. példában részletezett lépések szerint. Kettős szálú cDNS-t szintetizálunk hasonlóképpen, mint az 1. példában és hosszabb, mint 600 bázispárt tartalmazó cDNS-t (2,4 pg") nyerünk szacharóz sűrűség gradiensen történő frakcionálás után. A cDNS-t ezután dCMP gyökkel kiterjesztjük, terminális dezoxinukleotidil transzferázt alkalmazva és egy 50 ng-os alikvotot forrasztunk /össze 250 ng dGMP-vel meghosszabított, Pstl'-el hasított pBR 322-vel. Az így létrejött hibrid plazmidokat használjuk az E. coli K 1776 transzformálására és mintegy 4000 klón transzformánst nyerünk. A Grunstein-Hogness módszer szerint három, 3—16 cDNS plazmiddal (amelyet vizsgáló mintaként használtunk) komplementer kiónt szelektálunk ki. Az így szelektált kiónok transzformált, emberi IL-2 génnel rendelkező kiónok. 5. Példa Egy plazmidot, amely irányítja a humán IL-2 szintézisét E. coli sejtben, alakítunk ki a következőképpen: pTIL2-22 plazmidot alakítunk ki pTrS-3-ból (Nishi, T., Taniguchi, T. és munkatársai: SEIK.AGAK.LI 53,976 (1981)) és IL-2 cDNS-t tartalmazó pIL2-50A-ból egy sor módosítási folyamat segítségével, amint ezt az 5(a) ábra bemutatja. A pTrS-3 plazmid magába foglalja a Trp promoter és a Shine Dalgarno (a továbbiakban SD) terület beiktatását a pBR 322 EcoRI helye és Clal helye között. A plazmid tartalmaz egy ATG indító kodont is 13 bp-re az SD szekvenciától lefelé, valamint egy egyedi Sphl helyet, amint ezt a 4. ábra bemutatja. A vektor akkor tudja hatásosan előállítani a szóban forgó fehérjét, amikor az említett fehérjének megfelelő DNS szekvencia éppen az ATG kodontól lefelé levő fázisban van, amely kodont a SphI-el történő emésztés és az ezt követő T4 DNS polimerázzal történő kezelés váltja ki a ptrS-3-ban. Ennél fogva a pTrS-3 plazmidot (30 pg) elhasítjuk S£hj_ restrikciós enzimmel hagyományos módon, majd az egymás után fenollal és kloroformmal történő kezelés után etanolos csapadékot nyerünk ki, majd mindkét végét T4 DNS polimerázos kezeléssel egyenesre alakítjuk. Ez után a DNS-t (21,4 pg) kinyerjük a koróbbiakhoz hasonló módon egymást követő fenolos, majd kloroíormos kezeléssel és etanolos kicsapással. Másrészt 380 pg IL-2 cDNS-t tartalmazó pIL2'50A-t hasítunk Pstl-el és az IL-2 cDNS inzertet agaróz gél elektroíorézissel izoláljuk. 11 pg cDNS inzertet hasítunk el HgiAI-el, kezeljük T4 DNS polimerázzal és a nagyobb méretű DNS 10 pg-ját izoláljuk agaróz gél elektroforézissel. Az eljárás szerint egy 132 aminosavat kódoló cDNS-t (7,2 pg) nyerünk és ez a DNS fragmens levágott végekkel rendelkezik (5(a) ábra). Ez után az így nyert cDNS-t összekapcsoljuk egy pTrS-3 vektorral, amelyet korábban SphI-el emésztettünk és T4 DNS polimerázzal kezeltünk, 31 éppen az ATG szekvenciától lefelé. Az így összekapcsolt plazmidot alkalmazzuk azután az E. coli HB 101 transzformálására a hagyományos eljárások szerint. Az összekapcsolást a következő módon végezzük: IL-2 cDNS (0,4 pg) nagyobb fragmenst és 0,2 pg pTrS-3 vektor DNS-t összekeverünk 0,8 egység T4 DNS ligázzal 66 mmól/literes Tris-HCI oldatban (pH 7,5), amely 6,6 mmól/liter MgCI2-t, 1 mmól/liter ATP-t és 10 mmól/liter DTT-t tartalmaz, és a keveréket reagálni hagyjuk egy éjszakán át 4°C hőmérsékleten. Az arnpicillint tartalmazó L-tápanyag - agaron megjelenő transzformánsok közül 132 aminosavat kódoló IL-2 cDNS részt tartalmazó telepeket szelektálunk in situ telep-hibridizációs vizsgálattal. Az így szelektált telepeket tenyésztjük (10 ml) ismét plazmid DNS készítése érdekében lizozinos kezeléssel vagy fagyasztás-felengedtetéssel. A plazmid DNS-t Pstl-el és Xbal-el hasítjuk és az így létrejött termékeket agaróz gél elektroforézissel analizáljuk, abból a célból, hogy azonosítsuk a pTIL-2-22-t, amelyben a cDNS a TrS-3 ATG szekvenciájához a helyes orientációban van hozzácsatolva. A pTIL2-22-t tartalmazó E, coli HEt 101 -et a mikroorganizmusok szaporításához ismert hagyományos körülmények között tenyésztjük. A sejteket 10 ml X tápközegben növesztjük (2,5% Bacto-tripton, 1,0% élesztőkivonat, 0,1%' élesztőkivonat, 0,1% glükóz, 20 mmól/liter MgS04, amely tartalmaz még 25 pg/ml streptomicint és 25pg ampicdlint) 37°C hőmérsékleten egy éjszakán át. Egy ml tápközeg-szuszpenziót inokulálunk azonos X tápközegbe (100 ml) és tenyésztünk 37°C hőmérsékleten. Amikor az O. D. 650 mpnal eléri a mintegy 1,5—2,0 értéket, 3-indol-ak'ilsavat (IAA) adagolunk. Három órával az induktor adaglása után a sejteket összegyűjtjük, 20 mmól/liter Tris-HCI pufferral — amely 30 mmól/liter NaCl-t is tartalmaz — mossuk és 8 ml hasonló pufferban felszuszpendáljuk. A Trp promotor hatásosabb ténykedése érdekében induktorokat, pl. lAA-t aduik hozzá 50 pg/ml végső koncentráció eléréséig. A bakteriális sejtben így előállított fehérjéket ultrahang-kezeléssel (0°C, 2 perc) nyerünk ki, vagy lizozimos emésztéssel (8pg lizo7;im, 0°C, 20 perc), ezt követi három íagyasztás-felengedtetés eljárás egymás után. A jelen eljárás szerint az lL-2-t általában az organizmusokból extraháljuk. Az extrahált IL-2 aktivitás 10 000 és 12 000 egység közötti értékeken mozog. A PTIL2-22-t tartalmazó E. coli HB 101 törzset (AJ 12004) FERM-BP 245 befogadási számmal letétbe helyeztük. 6 Példa IL-2 cDNS-t hordozó pTuIL-2-22 plazmidot alakítunk ki pTuBIP-5-ből (Taniguchi, T. és munkatársai: SE1KAGAKU, 53, 966 (1981)) és pTIL2-22-ből, amelyet az 5. példában mutattunk be, a 7. ábrán látható eljárás segítségével. Egy pTuBIP-5 plazmid magában foglal egy tufB-hez szolgáló promotor beikta32 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
