197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
3 197937 4 kodon ja specifikus információt hordoz. így például az adenin-timin-guanin triplet olyan mRNS szignált eredményez, amely meghatározza a transzláció kezdetét, ugyanakkor a transzláció végét a terminációs kodonok, a ÍAG, TAA és TGA határozza meg. Az iniciációs és a terminációs kodon között az úgynevezett strukturgén helyezkedik el, vagyis azok a kodonok, amelyek a transzlatált aminosav-szekvenciát írják le. A definíciók a jól megalapozott genetikai kódból származtathatók (például Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; New York, Benjamin, Inc., 1976), a genetikai kód a különböző aminosavakat leíró kodonokat határozza meg. Mivel 64 lehetséges kodon szekvencia létezik, de csak 20 ismert aminosav van, a genetikai kód degenerált abból a szempontból, hogy különböző kodonok hasonló aminosavakat határoznak meg. Ugyanakkor a kód fontos abból a szempontból, hogy mindegyik aminosavra legalább egy kodon létezik, és abban, hogy mindegyik kodon csak egy aminosavat ír le, és nem többet. így például a TTT, TTC, TTA és TTG kodonok szerint határoznak meg, és nem más aminosavat. Nyilvánvaló, hogy a transzláció során a megfelelő leolvasási fázist és irányt be kell tartani ahhoz, hogy a termelődő polipeptid megfelelő aminosav-szekvenciájú legyen. A szabályozó génszakaszon belül eső azt a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely a transzkripció kezdetét határozza meg, a gén promoterének nevezzük, ugyanakkor a dezoxi-ribonukleinsavon a strukturgént követően elhelyezkedő specifikus szignált, amely a transzkripció végét írja le transzkripciós terminációs helynek nevezzük. Bár a transzkripció iniciálása és terminálódása nem teljesen ismert mechanizmus szerint folyik, valószínű, hogy a promoteren van az a hely, ahol a ribonukleinsav-polimeráznak kötődnie kell ahhoz, hogy a transzkripció elkezdődjön, és valószínű az is, hogy egy adott promoter vagy terminációs szignál hatékonysága vagy „ereje“ attól függ, hogy milyen hatékonysággal képes a ribonukleinsav-polimeráz felismerni és kapcsolódni ezekhez a jelekhez. Ez ugyanakkor nagyrészben attól függ, hogy milyen a dezoxi-ribonukleinsav bázis-szekvenciája ezen a helyen, vagy ehhez a helyhez közel [lásd Rosenberg és munkatársai, Ann. Rev. Genet., 13, 319— 353 (1979)]. Egyes gének szabályozó szakaszai tartalmazhatnak olyan-dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat, amelyeket bizonyos effektor molekulák felismernek, ezek hatására pozitívan vagy negatívan változik a ribonukleinsav-polimeráz és a dezoxi-ribonukleinsav kölcsönhatása, és ezzel tovább szabályozódik a génkifejeződés a transzkripciós szinten. Az ilyen génekben kódolt genetikai információ kifejeződése gátlódhat például egy adott anyag hiánya esetén, ezért ezt indukálható génnek nevezzük. Másrészről, léteznek olyan gének (például a Gram-negatív Escherichia coli baktérium lipoprotein génje), amelyek szabályozó szakaszait effektor molekulák nem befolyásolják. Az ilyen gének genetikai információjának kifejeződése a sejt élete során folyamatos, és ezért konstitutív géneknek nevezzük ezeket. Az ilyen gének szabályozó szakaszai általában egy promoter és egy terminátor szignálból állnak, ezek megelőzik, illetve követik a leírásra kerülő dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát. Az mRNS szintézist elindító szabályozó szakaszok, a transzkripciós iniciációs hely a promotVren vagy annak közelében helyezkedik el, és a transzkripciós terminációs helyig tart, ezáltal egy meghatározott hosszúságú és bázis-szekvenciájú olyan mRNS molekula jön létre, amely komplementer a leírt dezoxiribonukleinsav bázis-szekvenciájával. A két pont között elhelyezkedő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia nemcsak a strukturgént határozza meg, azaz a transzlatált polipeptid kodonjait, de meghatároz a strukturgén egyik oldalán egy úgynevezett nem transzlatált szakaszt is. A transzkripció során így olyan mRNS molekula jön létre, amely egy transzlatálható RNS-szekvenciát tartalmaz két transzlációra nem kerülő szakasz között. A struktúr-szekvenciát megelőző, nem transzlatált szakaszt 5’-nem transzlatált szakaszként ismerjük, míg a struktúrjeleket követő szakaszt 3’-nem transzlatált régióként említjük, Ahogy azt az alábbiakban ismertetjük, a találmány szerinti új klónozó hordozók előállításakor a fenti nem transzlatált szakaszokat leíró dezoxi-ribonukleinsav kódoló szekvenciákat, továbbá bizonyos gének promoter szignálját és terminációs szignálját leíró dezoxi-ribonuk'einsav kódoló szekvenciákat, azaz együttesen elnevezve a funkcionális génfragmenseket hatékonyan felhasználjuk. A leírás során klónozó hordozó alatt egy olyan nem kromoszómális, kétszplú plazmid dezoxi-ribonukleinsav molekulát értünk, amely egysejtű mikroorganizmusba juttatva (transzformálva) replikálódni képes. Az így transzformált mikroorganizmust transzformánsnak nevezzük. A jelen leírás során plazmid alatt értünk egy kör alakú, nem kromoszómális, kétszálú, olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulát, amely vírusból vagy baktériumból ered, ez utóbbit bakteriális plazmidnak nevezzük. A biokémia jelen években tapasztalható fejlődése a rekombináns klónozó hordozók előállításához vezetett, a hordozókban, például a plazmidokban idegen, külső dezoxi-ribonukleinsav van. Az egyes esetekben a rekombináns plazmid az adott, transzformációra érzékeny mikroorganizmusban közönséges körülmények között nem termelődő polipeptidet leíró dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazhat, a külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav egyes esetekben humán genetikai anyagot tartalmazhat. A pdazmidokat hasítják, 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
