197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 6 amikor ligálható végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat kapnak. Ezeket a molekulákat ligálható végekkel rendelkező külső (idegen) génhez kapcsolják, amiután egy adott fenotípust meghatározó, biológiailag funkcionális molekulához jutnak. A rekombináns molekulát transzformációval egy mikroorganizmusba juttatják, és a transzformánsokat izolálást követően klónozzák, majd a nagyszámú sejtből álló populáció kifejezi az új genetikai információt. Az irodalomban széleskörűen ismertetik a rekombináns klónozó hordozók és transzformánsok előállításának módszereit és eszközeit, általános ismertetőként lásd például Cohen, Scientific American, 233, 24—33, 1975. július és Gilbert és munkatársai, Scientific American, 242, 74— 94, 1980. április. Dezoxi-ribonukleinsav rekombinációhoz több technika áll rendelkezésünkre, ezek szerint különböző dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek végeit összekötjük, ligáljuk. A ligálás a foszfodiészter-kötések kialakulását jelenti a szomszédos nukleotidok között, a reakciót például a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz katalizálja. A blunt (tompa) végekkel rendelkező dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek közvetlenül ligálhatók. A komplementer egyszálú összekötendő végekkel rendelkező fragmensek hidrogén-kötéssel kapcsolhatók össze és ezután ligálhatók. Ilyen egyszálú végek, általában kohézív végeknek nevezzük ezeket, kialakíthatók oly módon, hogy terminális transzferázzal nukleiotidokat kapcsolunk a tompa végekhez, esetleg lamba-exonukleázzal egy szálat leemésztünk, amiután tompa véghez jutunk. Legáltalánosabban azonban az egyszálú végeket restrikciós endonukleázokkal, úgynevezett restrikciós enzimekkel alakítjuk ki, ezek egy adott, 4—6 bázispárból álló nukleotid-szekvencia mentén hasítják a foszfodiészter kémiai kötéseket. Több restrikciós endonukleázt ismerünk az általunk felismert szekvenciával együtt, az úgynevezett EcoRI endonukleáz egyike a legszélesebb 'körűen használt enzimeknek. Az adott szekvenciák mentén a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavat hasító restrikciós endonukleázok (például a forgási szimmetriával rendelkező palindrom szekvenciák) kohézív végű molekulát eredményeznek. így egy plazmidot vagy más klónozó hordozót hasíthatunk, amiután a restrikciós endonukleáz által felismerhető hely felét képviselő végeket kapunk. Egy hasonló restrikciós endonukleázzal hasított idegen dezoxi-ribonukleinsav a plazmid végekkel komplementer végekkel rendelkezik. A hasított hordozóba beépíthetünk kohézív végekkel rendelkező szintetikus dezoxi-ribonukleinsavat is. Annak meggátlására, hogy a hordozó kohézív végei önmagukkal újra kapcsolódjanak, amikor a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítése gátolttá válhat, a végeket alkalikus foszfatázzal kezelhetjük, amikor tulajdonképpen molekulá5 ris szelekciót végzünk a külső fragmens beépítésének érdekében. Elősegíthetjük egy fragmens beépítését a hordozó más helyeihez viszonyítva megfelelő orientációban oly módon, ha a hordozó dezoxi-ribonukleinsavat két különböző restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a fragmens maga a két adott, különböző endonukleáz által felismerhető szekvencia felét-felét hordozza a végein. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kutatás utóbbi években bekövetkező fejlődése révén több sikeres és könnyen alkalmazható módszer vált ismertté funkcionális polipeptid kifejezésre, például az inzulin, szomatosztatin és a humán,és állati növekedési hormon, A jelen leírás ezen módszerek továbbfejlesztésére vonatkozik. Több olyan rekombináns baktérium plazmid klónozó hordozót ismertetünk, amelyek alkalmasak transzformált baktérium sejtben külső gének kifejezésére, és amelyek az adott polipeptidet kódoló beépített dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst tartalmazzák leolvasási fázisban, egy vagy több, olyan funkcionális fragmenssel, amelyek valamely Gram-negatív baktérium külső membrán protein génjéből származnak. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint a külső dezoxi-ribonukleinsav emlős hormonokat, enzimeket vagy immunogén proteineket (vagy ezek intermedierjeit) határoz meg, a funkcionális fragmensek pedig az E. coli lipoprotein génjéből származnak: az adott polipeptidet E. coli transzformánsokban fejezzük ki. A találmány szerinti eljárás egy előnyösebb kivitelezési változata szerint az adott proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát négy specifikus, olyan funkcionális fragmenssel kapcsolva fejezzük ki, amelyek az E. coli lipoprotein génjével vannak kapcsolatban, nevezetesen a promoterrel, az 5’-nem transzlatált szakasszal, a 3’-nem transzlatált szakasszal, és a gén transzkripciós terminációs helyével. Ezek a kifejeződő plazmidok egy második promotert is tartalmazhatnak, előnyösen indukálható promoted és legelőnyösebben az E. coli ß-galaktozidüz vagy lac promoterét; ezt a lipoprotein promoter közvetlen közelében a DNS-en lefelé haladva építjük be úgy, hogy az exogén (idegen) dezoxi-ribonukleinsav csak abban az esetben fejeződik ki, ha laktóz inducer van jelen. Indukáltkor az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav mindkét promoterről átíródik, így fokozódik az adott termék hozama. Ily módon mind konstitutív, mind pedig indukálható gének kifejezése elérhető. Indukálható klónozó hordozók esetén különleges E. coli törzseket használunk transzformánsként, különösen azok előnyösek, amelyek a laktóz represszor molekulát túltermelik. A vad típusú E. coli sejtben csak 10 laktóz represszor molekula létezik bármely időpontban, ez éppen elég ahhoz, hogy a sejtben közönséges körülmények között jelen -5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
