197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 4) A pKEN018 plazmid előállítása A 9. ábrán szemléltetjük a 3’-nem transzlatált szakaszt és az lpp gén transzkripciós terminációs helyét hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens klónozásának stratégiáját. A célra választott fragmens a pKENI 11 0,95 kb nagyságú PvuII-Hpal fragmense, ezt az 5. ábra 105D helyén sematikusan ábrázoljuk. Mivel a PvuII restrikciós enzim az lpp gént a +167 és +168 bázisok között hasítja, ez a fragmens az lpp körülbelül felét tartalmazza (lásd az 1. és 5. ábrát). A promoter fragmenshez viszonyítva, hasonló orientációba a klónozó hordozóba úgy építjük be ezt a fragmenst, hogy BamHI és Sáli linkért kötünk a pvull illetve a Hpal hasítási helyekre. A 9. ábra 117 helyén sematikusan ábrázoljuk azt, ahogy a pKENI 111 plazmid dezoxi-ribonukleinsavból egy 2,8 kb nagyságú EcoRI fragmenst kapunk EcoRI restrikciós enzimmel való emésztéssel, és poliakril-amid gélen való frakcionálással. 10 pg ily módon tisztított fragmenst PvuII restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk 500 pl HaelII pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakció leállítására fenolos extrakciót végzünk, majd az elegyet éterrel extraháljuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, 200 pl 0,3 mólos nátrium-acetátban újra oldjuk és 0,5 ml etanollal ismételten kicsapjuk. 5 pg PvuII emésztéssel kapott, 2,8 kb nagyságú EcoRI fragmenst 390 pikomól foszforilezett BamHI linkerrel keverünk, és tompa-végligációt végzünk 6 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 25 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, I2,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakcióelegyet 150 pl térfogatúra egészítjük ki HaelII pufferral, és a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz inaktiválására 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 60 egység HaelII restrikciós enzim adagolását követően 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. Mivel a Collaborative Research cégtől vásárolt, és az EcoRI linker kapcsán leírtakhoz hasonlóan foszforilezett BamHI linker 5’-CCGGATCCGG-3’ bázis-szekvenciával rendelkezik, a HaelII restrikciós enzim 5’ GGCC3’ 31CCGG51 bázisszekvenciájú felismerő helye megfelel az előzőnek, így mindkét linkért a fentivel előállítottnak tekinthetjük. A HaelII restrikciós enzim használatakor a BamHI linkerrel kapcsolt PvuII fragmensek (ezek a fragmensek nem tartalmaznak semmiféle HaelII hasítási helyet) elvesztik a fölös BamHI linker fragmenseket, amelyek a PvuII véghez kapcsolódnak, és ezután csak egy olyan linker fragmens marad hátra, amely közvetlenül kapcsolódik ehhez a véghez. Ez a folyamat nagyban egyszerűsíti az lpp gén 3’-végét tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-frag-29 16 mens tisztítását, ahogy azt az alábbiakban megadjuk. A HaelII enzimet úgy inaktiváljuk, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket Hpal restrikciós enzimmel teljesen emésztjük 400 pl Hpal-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. Fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 pl gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakción áljuk. A 0,95 kb-nak megfelelő helyre elmozdult dezoxi-ribonukleinsav csíkot kihasítjuk a gélből, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel leeluáljuk. Fenolos extrakcióval eltávolítjuk az etidium-bromidot, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, 200 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk, 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. így 1 pg tiszta, 0,95 kb nagyságú HaelII-Hpal fragmenst kapunk, ezt a 9. ábra 118 helyén mutatjuk be. 120 pikomól foszforilezett Sail linkért (5,-GGTCGACC-3’; a Collaborative Research terméke, az előzőekben megadottak szerint foszforileztük) keverünk 0,75 pg, 0,95 kb nagyságú tisztított HaelII-Hpal fragmenssel, majd ezután tompa-végligációt végzünk 3,5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 25 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakcióelegy térfogatát megfelelő mennyiségű BamHI pufferral 300 pl-re egészítjük ki, és ezután 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegyhez megfelelő mennyiségű BamHI és Sáli restrikciós enzimet adunk, és 2 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a PvuII, illetve Hpal végekhez kapcsolt BamHI és Sáli linkerek hasítása céljából, amiután kohézív végeket kapunk. A kapott 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenst a 9. ábra 119 jellel jelölt helyén mutatjuk be. A restrikciós endonukleázokkal való emésztést úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. A kísérlet ezen fázisában a 150 pl térfogatú elegy körülbelül 0,38 pg, 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenst tartalmaz. Az elegyet 1 pg pKEN014 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverjük, ezt a ribonukleinsavat előzőleg azonban BamHI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük és BAP-vel kezeljük (lásd a 9. ábra 120 jellel jelölt helyét). A pKEN014 plazmid a pBR322 plazmidból származik oly módon, hogy az utóbbiból kihasítunk egy 346 bázispárból álló HindlII-BamHI fragmenst, amely a tetraciklin rezisztencia gén nagy részét tartalmazza. A fragmenst azért hasítjuk ki, hogy a kifejeződő plazmid nagyságát lehető legkisebb 30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
