197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
értéken, körülbelül 5 kb-on tartsuk. A fragmens delécióját a 9. ábra 121 jellel jelölt helyén bemutatottak szerint végezzük HindlII emésztéssel, és ezt követően SÍ nukleázos kezeléssel. Ezt a kezelést 1 órán át 20°C hőmérsékleten végezzük, majd BamHI linkért kapcsolunk a fragmenshez, BamHI enzimmel teljesen emésztjük, T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal újra zárjuk a molekulát, és tetraciklinre érzékeny transzformánsokra szelektálunk. A pKEN014 linearizált dezoxi-ribonukleinsavat és a 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenseket tartalmazó keveréket fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk és 200 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. A fragmensek kohézív végeit 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk 60 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 12 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 törzset (NRRL B-15013) transzformálunk, és 12 ampicillinre rezisztens transzformánst egy éjszakán át 1 ml, 50 pg/ /ml ampicilünt tartalmazó L-táptalajban tenyésztünk. 0,5 ml tenyészetből gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat, és agaróz gél-elektroforézissel analizáljuk. 5 plazmid dezoxi-ribonukleinsav hordozza a 0,95 kb nagyságú BamHI-Sall fragmenst, a plazmidok egyikét pKEN018 jellel jelöljük. A pKEN018 plazmid dezoxi-ribonukleinsav dezoxi-ribonukleinsav-szekveriálása azt mutatja, hogy a plazmid szerkezete a 9. ábra 122 helyén megadottakkal azonos. Az eredmények szerint a BamHI linker a PvuII helyre az lpp génen belül megfelelő pozícióba kapcsolódott be. 5) A pKEN021 plazmid előállítása Az lpp gént hordozó klónozó molekula A helyének beépítése során a következő lépés az, hogy az lpp promoter fragmenst kombináljuk, mégpedig hasonló orientációban a transzkripciós terminációs fragmenssel. A lépés értelmében a pKEN018 630 bázispárból álló Pvul-EcoRI fragmensét kicseréljük, ahogy azt a 10. ábrán leegyszerűsítve ábrázoljuk. Ügy járunk el, nogy 20 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat teljesen emésztünk (lásd a 10. ábra 123 helyén jelzetteket) Pvul restrikciós endonukleázzal 100 pl BamHI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1,5 órán át. A Pvul enzim inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd ezután a reakcióelegyhez 52 pl vizet, 40 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=7,5), 4 pl, 0,1 mólos magnézium-kloridot és 40 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk. 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenollal extrahálunk. 31 k dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 pl gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. Miután az elkülönült dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket eluáljuk a gélről, 4 pg, 1,1 kb nagyságú Pvul-EcoRI fragmenshez jutunk. 0,75 pg tisztított fragmenst ezután 0,6 pg pKEN018 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, amelyet előzőleg kétszeresen emésztettünk Pvul, illetve EcoRI restrikciós enzimmel, és BAP-vel kezeltünk (lásd a 10. ábra 124 helyét). A Pvul és az EcoRI kohézív végeket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal összekötjük 50 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 25 pl ligáit eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokbói izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat és agaróz gél-elektroforézissel analizáljuk. A restrikciós enzimmel végzett térképezés szerint a plazmidok egyike a 10. ábra 125 helyén megadott szerkezetű, ezt pKEN021 jellel jelöljük. 6) A pKEN037 plazmid előállítása Az lpp gént tartalmazó kifejeződő plazmid első A helyének előállítása során az utolsó lépést all. ábrán mutatjuk be. Ahogy azt a 11. ábra 126 helyén látjuk, a pKEN021 hordozza az lpp promoter fragmenst és az lpp transzkripciós terminációs fragmenst, a kettőt a pBR322-ből származó 32 bázispárból álló fragmens választja el. Az utóbbi fragmens deléciójával és az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia beépítésével megkapjuk az adott polipeptid kifejezésére alkalmas funkcionális csoportot. Mivel a 32 bázispárból álló fragmens végein EcoRI és BamHI hasítási helyeket találunk, a pKEN021 plazmid szerkezetéből adódóan csak olyan külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst építhetünk be, amely EcoRI-EcoRI, BamHI-BamHI vagy EcoRI-BamHI kohézív végekkel rendelkezik. A beépíthető külső gének számának növelése érdekében, továbbá más kohézív végek kombinációjával végződőek integrálhatósága érdekében ezen szakasz dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját megváltoztatjuk oly módon, hogy a létező EcoRI és BamHI helyek közé egy HindlII hasítási helyet építünk be. Ügy járnak el, hogy a pKEN021 bázispárból álló HindlII-Clal fragmensét elimináljuk a plazmid nagyságának csökkentése érdekében. Ennek érdekében 5 pg pKEN021 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység Clal restrikciós enzimmel hasítunk 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0, 10 mmól magnézium-klorid literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin. 32 197937 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
