197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 A találmány a rekombináns genetika területére vonatkozik, részletesebben olyan plazmid klónozó hordozók egy csoportjára, amelyekkel külső gének fejezhetők ki transzformáit baktérium sejtekben. A találmány szerint előállított plazmid klónozó hordozók olyan rekombináns plazmidok, amelyek egy Gram-negatív baktérium egy külső membrán protein génjéből származó legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmaznak, leolvasási fázisban hozzákötve a) egy olyan második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely egy indukálható promoted határoz meg, és b) egy olyan harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját írja le, vagy egy olyan inszerciós helyet, amely leolvasási fázisban kapcsolódik egy transzlációs kodonhoz, és amely alkalmas a fenti harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására; a fenti plazmidok tartalmaznak továbbá egy olyan negyedik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely a fenti indukálható promoter szignál helyéhez kapcsolódni képes represszor protein aminosav-szekvenciáját határozza meg, ezzel szelektíve gátolva az innen kiinduló transzkripciót. A rekombináns plazmidok előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy leolvasási fázisban összekapcsolunk egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán protein génjéből származó, legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát (első DNS-szekvencia) — a lac promoter-operátor rendszert meghatározó valamely dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (második DNS-szekvencia), és — egy, az adott, legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (harmadik DNS-szekvencia), vagy egy transzlációs iniciációs kodonnal leolvasási fázisban kapcsolt, az adott harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására alkalmas beépítési helylyel, és — a lacl gént kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (negyedik DNS-szekvenc'a). A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptid előállítására transzformált baktérium sejtben, oly módon, hogy a) a baktérium sejtet egy olyan rekombináns plazmiddal transzformáljuk, amely tartalmaz egy első olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely egy Gram-negatív baktérium külső membrán protein génjéből származó legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmaz leolvasási fázisban kapcsolódva egy olyan második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával, amely 1 egy indukálható promoter szignált határoz meg, és egy olyan harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával, amely a fenti polipeptid aminosav-szekvenciáját írja le; a fenti plazmid továbbá tartalmaz egy olyan negyedik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, amely egy olyan represszor protein aminosav-szekvenciáját határozza meg, amely az adott indukálható promoter szignálhoz kötődve szelektíven gátolja az innen kiinduló transzkripciót; b) izoláljuk és tenyésztjük a kapott baktériumsejtet, nagymennyiségű tenyészet előállítására; c) a tenyészethez a represszor proteinhez kötődni képes inducert adagolunk, amikor az adott represszor protein lehasad az indukálható promoter szignál-helyről, és végül d) az adott polipeptidet előállítjuk a tenyészetből. A találmány vonatkozik továbbá a rekombináns plazmidot tartalmazó transzformánsokra. Ahogy az a szakemberek körében jól ismert, a genetikai információ kétszálú dezoxi-ribonukleinsav (DNS) molekulában (génekben) van meghatározva, oly módon, hogy a dezoxi-ribonukleinsav kódoló szálja tartalmazza az ismétlődő nukleotid bázisokat. A dezoxi-ribonukleinsav nukleotidok két szálát jellemző négy nitrogéntartalmú bázis hidrogénhíd-kötésekkel komplementer párokká kapcsolódik, és így létrejön a kettős csigavonal. A négy bázis az adenin, ez a timinhez kapcsolódik, illetve a citozinhoz kapcsolódó guanin. A kódolt információ kifejeződése két részből álló folyamat során jön létre. A génben lévő bizonyos szabályozó szakaszok által meghatározott törvények szerint egy enzim, az RNS-polimeráz végighalad a dezoxi-ribonukleinsav kódoló szálján, és az úgynevezett transzkripciós folyamat során hírvivő (messenger) ribonukleinsavat (mRNS) szintetizál. A dezoxi-ribonukleinsav kódoló szál úgynevezett szignálokat tartalmaz, ezek képesek felismerni a ribonukleinsav-polimerázt, így elkezdődik, illetve befejeződik a transzkripció. Az ezt követő transzlációs lépés során a sejtek riboszómái a transzfer-ribonukleinsavval együtt a ribonukleinsavban lévő üzenetet proteinné vagy polipeptidekké fordítják, ezek meghatározzák a sejt alakját és funkcióját. A dezoxi-ribonukleinsavból származó és az mRNS molekulára átírt információ tartalmazza azokat a jeleket is, amelyek a riboszómális transzláció kezdetét és végét meghatározzák, tartalmaz további olyan jeleket, amelyek szigorúan meghatározzák a polipeptidet felépítő aminosavak minőségét és sorrendjét. A kódoló dezoxi-ribonukleinsav szál nukleotid tripletek hosszú szekvenciáját tartalmazza, ezeket kodonoknak nevezzük, és amely jellemző nukleotid bázisok mindegyik triplettje vagy 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
