197928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadorelin és gonadorelin-analóg hormonszintézis peptid köztitermékének racemátszegény előállítására
197928 tripeptidből az alábbiakban ismertetendő öt kapcsolási eljárással meglepően könnyen nyerjük a racemátszegény (I) általános képlett! terméket. A találmány szerinti eljárás, például a PPA-módszer alkalmazása, az azid-eljárással ellentétben nem esik biztonságtechnikai korlátozások alá. Ezen felül az eljárás gyakorlati-kémiai szempontból is éppilyen problémamentesnek bizonyult. A léptéknövelés a gyártásra sem a kitermelés csökkenéséhez, sem a termék tisztaságának romlásához nem vezetett (lásd a 6.1. példát). A (II) képlető csoport tripeptid reagáltatását a (III) általános képletű szabad aminocsoportot és védett karboxilcsoportot tartalmazó peptiddel előnyösen valamely, a peptidkémiában szokásosan alkalmazott oldószerben vagy víz — oldószer elegyben, alkalmas kondenzálószer jelenlétében végezzük, például: 1) diciklohexil-karbodiimidet és 1-hidroxi-benzotriazolt alkalmazunk [DCCI/HOBt eljárás; Chem. Bér. 103, 788 (1970)] vagy 2) diciklohexil-karbodiimidet és 3-hidroxi-4- -oxo-3,4-dihidro-l ,2,3-benzotriazint alkalmazunk [DCCI/HOOBt eljárás; Chem. Bér., 103, 2034 (1970)] vagy 3) diciklohexil-karbodiimidet és N-hidroxi-szukcinimidet alkalmazunk [DCCI/ /HONSu eljárás; Z. Naturforsch., 21b, 426 (1966)] vagy 4) alkán-foszfonsavanhidridet, például n-propil-foszfonsavanhidridet alkalmazunk [PPA eljárás; Angew. Chemie, Int. Ed., 19, 133 (1980)] vagy 5) dialkil-foszfinsavanhidridet, például metil-etil-foszf insavanhidridet alkalmazunk [MEPA eljárás; 4 426 325. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Amennyiben a szintetizálandó gonadorelin analóg 6-helyzetű aminosavja savlabilis aminosavszármazék — mint például a D-Ser(But) nincs értelme, hogy az (I) általános képletben X helyettesítőként OBut csoportot tartalmazó köztiterméket állítsuk elő, a szintézist az X=^=OBut helyettesítő jelentésű köztiterméken át kell vezetni. •A találmány szerinti eljárásban alkalmas oldószerként oldhatósági okokból kifolyólag többnyire poláris oldószereket, például dimetil-acetamidot, dimetil-formamidot, dimetil-szulfoxidot, foszforsav-trisz(dimetil-amidot), 3 N-metil-pirrolidont, vizet vagy a felsorolt oldószerek vízzel alkotott elegyeit használjuk. Az utóbbi főként a MEPA eljárásnál bizonyul megfelelőnek. Ezeken kívül azonban kloroform, metilén-klorid vagy etil-acetát is használható. A reagáltatást —10°C és szobahőmérséklet között-hajtjuk végre, előnyösen 0°C-on kezdjük a reagáltatást és később emeljük a reakcióelegy hőmérsékletét szobahőmérsékletig. Előnyös az az eljárásváltozat, ahol X jelentése a következő: OBut, Arg-Pro-NHC2H5 vagy Arg-Pro-Gly-NH2. Különösen előnyös az az eljárásváltozat, ahol Z-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2-t és Z-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg -Pro-NHC2H5-t — ahol Z jelentése az előzőekben megadott — állítunk elő. A racemizálódásnak a találmány szerinti eljárás alkalmazása esetén jelentkező igen alacsony mértékét az egyébként (I) általános képletnek megfelelő, de Z helyett hidrogénatomot tartalmazó nem védett peptid nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással való vizsgálatával bizonyítottuk. Ha olyan, az előzőekben ismertetett (I) általános képletű hepta- vagy oktapeptidet állítunk elő, amelybe az A3 helyzetbe Tyr helyett D-Tyr-t építünk be, olyan terméket nyerünk, amelynek az A3 helyzetben Tyr-t tartalmazó vegyület összekapcsolás alatt történő racemizálódása során kell keletkeznie. Mivel ez a két diasztereomer nem védett pepiidként HPLC eljárással elválasztható, a racemizálódás mértéke az egyes öszszekapcsolási módszerek alkalmazásánál ellenőrizhető. I. Táblázat A racemizálódás mértéke Z-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt-t különféle, a táblázatban megadott módszerekkel állítunk elő és a kapott reakcióterméket tisztítás nélkül hidráljuk. A kapott terméket HPLC eljárással ellenőrizve H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt-nak találtuk. HPLC eljárás: Oszlop: NucleosilR 5SA (4X300 mm); eluálószer: 40% 1%-os, pH 5,8-as KH2P04 puffer, 60% acetonitril; áramlási sebesség 1 ml/perc; detektor: UV, 220 nm. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 3
