197928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadorelin és gonadorelin-analóg hormonszintézis peptid köztitermékének racemátszegény előállítására
197928 A találmány tárgya új eljárás az (I) általános képletű peptidek előállítására. Az (I) általános képletben Z jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport, A4 jelentése Gly vagy D-Ser(But) és X jelentése OBut, Arg-Pro-Gly-NH2 vagy Arg-Pro-NH(l—3 szénatomos alkil). A találmány szerint az (I) általános képlett! pepiidet (II) képletű tripeptid — ahol Z jelentése az előzőekben megadott — és (III) általános képletű peptid — ahol A4 és X jelentése az előzőekben megadott — vagy ennek savaddíciós sója reagáltatásával nyerjük. Az (I) általános képletű peptidek a gonadorelin szintézis vagy analógiái előállításának köztitermékei. Más ilyen célra alkalmas vegyületeket ismertetnek a Biochem. Biophys. Rés. Commun. 43, 1334—39 (1971) szakirodalmi helyen, illetve a 4 024 248. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.) A Biochem. Biophys. Rés. Commun. 43, 1334—39 (1971) szakirodalmi helyen sertés LH és FSH-felszabadító hormont, illetve annak aminosavszekvenciáját [ (piro)Glu-His-T rp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2] írják le. A 4 024 248. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan nagy LH-RH/FSR-RH aktivitású vegyületeket ismertetnek, amelyek (VI) általános képletében X jelentése D-Ser(Bu'), D-Cys(Bu'), D-Asp(OBu'), D-Glu(OBu'), D-Orn(Boc) vagy D-Lys(Boc) és Y jelentése glicinamid, NHC2H5 vagy NH-ciklopropil. Ismeretes, hogy a (IV) képletű gonadorelin (LHRH) a hipotalamusból származó hormon, amely a hipofízisben az LH és FSH gonadotróp hormonok felszabadulását kiváltja. Gonadorelin (LHRH)-analógként azok a peptidek jöhetnek számításba, amelyekben az LHRH egy vagy több aminosava ki van cserélve és/vagy a peptidlánc az LHRH láncához képest rövidített vagy hoszszabbított és/vagy az LHRH valamely származékai. Különös jelentőségűek azok a peptidek, amelyekben a 6-helyzetű glicin helyén valamely D-aminosav áll és a 10-helyzetű glicin helyén valamely helyettesítő csoportot, például alkil-amino-csoportot tartalmaznak. Példaként az (V) képletű buzerelint említjük. A szakirodalomból ismeretesek az (I) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárások /Biochem. Biophys. Rés. Commun., 45, 767 (1971); 4024 248. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], amelyek közül az azid eljárással végzett szintézis a fragmentum szintézisek körében kevéssé racemizáló eljárásként ismert [Id. a J. Chem. Soc. (London), 1960, 3902 és Helv. Chim. Acta, 44 1991 (1961) szakirodalmi helyeken] . Az azid eljárás alkalmazása esetén azonban számos mellékreakció jelentkezésével 2 1 kell számolnunk. így 1,2-diacil-hidrazín keletkezésével mindenekelőtt akkor kell számolnunk, ha az azidképzés alatt savhiányos állapot uralkodik. Ebben az esetben a tirozin a fenolos hidroxilcsoporthoz képest orto-helyzetben nitrálódhat, a triptofánon pedig N-nitrozálódás következhet be. Megfigyelhető a peptid-azid megfelelő amiddá való átalakulása is. [Lásd a Liebigs Ann., 659, 168 (1962) és a Synthesis (1974) 549 szakirodalmi helyeken közölt összefoglaló irodalmat.) Jelentős fogyatékossága az eljárásnak a peptid-azidok instabilitása. A peptid-azid már enyhén emelt hőmérsékleten Curtius-lebomlás révén izocianáttá alakulhat és ennék folytán karbamid és más melléktermékek képződnek [lásd a Helv. Chim. Acta, 44, 1991, S. 1997 (1961) és a Synthesis (1974) 549 szakirodalmi helyeken]. A feldolgozása során éppen ezek az izocianát képzéssel és ezt követő karbamid keletkezéssel járó mellékreakciók voltak megfigyelhetők (lásd a 4.1 és 4.2 példákban). A karbamidszármazék mellékterméket igen nehéz a megfelelő peptidtől elválasztani és jelenlétük csak nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) igazolható. A mellékreakció mértéke a 15%-ot is elérheti (lásd a 4.2 példában). Az azid szintézis hozama ritkán haladja meg a 70—80%-ot. Ezt az előzőekben felsorolt mellékreakciók okozzák. Az azid képző eljárás gyártási léptékben nem használható. Az eljárás során keletkező azoimid vagy sói az azidok bizonyos menynyiségen felül technikailag nehezen leküzdhető biztonsági rizikófaktort jelentenek. így például körülbelül 25 kg tripeptid-azid alkalmazásakor a feldolgozás során, például savas extrakció esetén legalább 1 kg azoimid keletkezik, amely heves robbanáshoz vezethet (lásd Römpps Chemie Lexikon, 7. Auflage, Frankh’sche Verlagshandlung, Stuttgart 1975, S. 3348). Ennek a rizikónak a leküzdésére számos drága méréstechnikai folyamatellenőrzést kellene kifejleszteni és üzemb.ehelyezni. Ezen kívül szükséges lenne gondoskodni az anyalúgoknak és a vizes extraktumoknak azoimidtől és sóitól való mentesítésére, ami ugyancsak nagy analitikai ráfordítást igényelne. Az azoimidet ezen kívül még munkavédelmi szempontból is kedvezőtlennek tekintjük, ez igen alacsony MAK-értékében fejeződik ki. Az azoimid MAK-értéke 0,1 ml/m3, illetve 0,27 mg/m3 (TRga 900, 1982). Az eddigiekben megnevezett okok lehetetlenné tették az azid-eljárás laboratóriumi méreten túli léptéknövelését. Célul tűztük ki az (I) általános képletű vegyületek előállítását az azid módszernél kedvezőbb eljárással. Azt találtuk, hogy a kevéssé racemizáló eljárással előállított új (II) képletű védett 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 65
