197917. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklinon-vázas glikozidok tisztítására gyantákon való szelektív adszorpció útján
5a) példa A 4’-epi-doxorubicin tisztítása (a technika állása szerinti eljárással) Szennyezett 4’-epi-doxorubicint (40 g, titer 60%) 1000 ml 98:2 térfogatarányú DCM-metanol elegyben szuszpendálunk. A szuszpenziót fel visszük egy 10 cm átmérőjű oszlop tetejére. Ezt 1,6 kg szilikagél 60-nal töltöttük meg (70—230 mesh) — az US Burean of Standards szerint (0,22— 0,065 mm) —, amelyet előzetesen 98:2 térfogatarányú DCM:metanol eleggyel mostunk. A terméket először 948:50:2 térfogatarányú DCM.metanoLvíz eleggyel, majd sorrendben a következőkkel eluáljuk: DCM.metanol.víz 930:67:3 térf./térf. DCM:metanol:víz 920:75:5 térf./térf. DCM:metanol:víz 1000:100:6 térf./térf. A terméket tartalmazó eluátum frakciókat vákuumban kis térfogatra töményítjük be és 100 ml n-propilalkohol hozzáadása után 0,1 N sósavval pH 4,5-re állítjuk be. A terméket 500 ml 40—70°C forráspontú petroléter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, 3X X50 ml petroléterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. 22 g 4’-epi-doxorubicin-hidrokloridot kapunk, amelynek szennyezés-tartalma 5-7%. 5b) példa A 4’-epi-doxorubicin tisztítása (a találmány szerinti továbbfejlesztett eljárással) 15,0 g, 75,9%-os 4’-epi-doxorubicint, amely 15% szennyezést tartalmaz, feloldunk 4000 ml vízben. Az oldat pH-ját nátrium-formiáttal 4,8-rá állítjuk, majd az oldatot felvisszük egy 400 ml Amberlite IRC 724 gyantával töltött, 2,5 cm átmérőjű oszlopra; áramlási sebesség; 1600 ml/óra (a gyantaágy térfogatának négyszerese) . Az oszlopot 800 ml vízzel mossuk, majd metanol, víz és tömény sósav 95:5:0,15 arányú elegyével eluáljuk. 4000 ml eluátumot gyűjtünk, amely a 4’-epi-doxorubicint tartalmazza, még mindig 10% szennyezés kíséretében. A további 1500 ml felfogott eluátum elsősorban szennyezéseket tartalmaz. A 4’-epi-doxorubicint tartalmazó eluátumot 1500 ml térfogatra betöményítjük, a betöményített oldat pH-ját nátrium-formiáttal 4,8-ra állítjuk, és felvisszük egy 250 ml karboxi-metil-cellulóz. gyantával (Whatman ) töltött, 2,5 cm átmérőjű oszlopra; áramlási sebesség: 500 ml/óra (a gyantaágy térfogatának kétszerese). Az adszorpció befejezése után az oszlopot etanol, víz és tömény sósav 99,3:0,7:0,015 arányú elegyével mossuk, majd etanol, víz és tömény sósav 90:10:0,05 arányú elegyével eluáljuk. 3200 ml eluátumot gyűjtünk. Az eluátumot csökkentett nyomáson 60 ml térfogatra betöményítjük, és a terméket 300 ml aceton hozzáadásával kicsapjuk. 7 Ily módon 6,0 g 91,2% titerű 4’-epi-doxorubicint kapunk, amely 3% szennyezést tartalmaz. Hozam: 55,3%. 6a) példa A doxorubicin tisztítása (a technika állása szerinti eljárással) 11,2 g — 88% titerű — szennyezett doxorubicint 110 ml vízben oldunk. CF 40 Whatman cellulózt adunk hozzá és a kapott szuszpenziót felvisszük egy 4 cm átmérőjű oszlop tetejé-e, amelyet cellulóz CF 12-vel (200 g) töltöttünk meg. Az oszlopot 80:10:1 térfogatarányú étiI- acetát:cel!oszolv:víz eleggyel eluáljuk. A doxorubicint tartalmazó eluált frakciókat 40 ml-re töményítjük be; a pH-t 0,05 N sósav hozzáadásával 2,0-ra állítjuk be és a terméket 160 ml aceton hozzáadásával kicsapjuk. Szűrés, acetonos mosás és vákuumban való szárítás után 6,7 g doxorubicint kapunk, amely 5% szennyezést tartalmaz. 6b) példa A doxorubicin tisztítása (a találmány szerinti továbbfejlesztett eljárással) a) lépés 70 g doxorubicint feloldunk 28 1 vízben. Az oldat pH-ját puffer-oldattal 3,7—4,5-re állítjuk, és az oldatot felvisszük egy 2 liter SÍ 12 KasteP gyantával töltött, 6 cm átmérőjű oszlopra. Az oszlopot 35 1 víz és 15 1 metanol elegyével eluáljuk. A 40 1 térfogatú eluátumot csökkentett nyomáson 0,5 1 térfogaira betöményítjük, és a termék kristályosítására a betöményített oldathoz keverés közben hozzáadjuk I I etanol és 4,5 I aceton elegyét, majd a rendszert 3 órán át 5°C hőmérsékleten kevertetjük. A kivált terméket kiszűrjük, 0,8 liter acetonnal mossuk és csökkentett nyomáson, 40°C hőmérsékleten 5 órán át szárítjuk. Ily módon 56,0 g ’észlegesen tisztított doxorubicint (I) kapunk. b) lépés 80,0 g a 6a) példában leírt eljárással előállított, részlegesen tisztított doxorubicint (I) feloldunk 24 1 vízben, és az oldat pH-ját puffer-oldat segítségével 4,0-ra állítjuk be. Az oldatot felvisszük egy 1,6 1 karboxi-metilcellulóz (Whatman) gyantával töltött, 12 cm átmérőjű oszlopra. Az oszlopból eközben kifolyó folyadékot elöntjük. Ezután az oszlopot 3,2 I vízzel mossuk, majd a terméket 55 I, sósavval pH=2,5-re állított vízzel eluáljuk. 46 1 eluátumot gyűjtünk, és az eluátumot csökkentett nyomáson 0,6 I térfogatra betönényítjük. A betöményített oldathoz óvatosan izopropanol és aceton 1:3 arányú elegyét adjuk; ekkor a termék kikristályosodik. 8 197917 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
