197769. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-42867 antibiotikum, addíciós sói és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
Kézikönyvek ismertetik az ilyen takarmány premixek és teljes takarmányok előállítási és adagolási módját (ilyen pl. a következő: W. H. Freedman & Co., Applied Animal Nutrition, San Francisce, USA, 1969 vagy Livestock Freeds and Feeding, O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977), amelyeket e hivatkozás révén a leírás részeivé teszünk. A találmányt a következő példákkal illusztráljuk. 1. példa: Az A 42867 antibiotikum előállítása A termelő organizmus (Nocardia sp. ATCC 53492) törzs-tenyészetét zabliszt agar lemezeken szélesztjük és a tenyészeteket 28°C-on 2 héten át inkubáljuk. A tenyészetből egy kacsnyi mennyiséggel beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikot, amely 100 ml, következő összetételű inokulum táptalajt tartalmaz: 15 dextróz 2,0% szójaliszt 0,8% élesztőkivonat 0,2% NaCl 0,1% CaC03 0,4% pH sterilezés előtt 7,3-re beállítva. A lombikot forgó rázógépen 28°C-on 72 órán át inkubáljuk. A tenyészetből 100 mlrel egy üvegfermentort oltunk be, amely 4 liter, ugyanilyen összetételű táptalajt tartalmaz és a tenyészetet 28°C-on 48 órán át inkubáljuk, kb. 900 ford./perc sebességgel végzett kevertetés mellett; a rendszert 1 standard liter/térfogat/perc menyiségű levegővel fuvatjuk át. 4 liter inokulum-tenyészetet átviszünk egy 200 liter, az inokulum-táptaiajjal azonos öszszetételű táptalajt tartalmazó fermentorba és a fermentációt 96 órán át folytatjuk, kb. 250 ford./ perc sebességű kevertetés és 1 standard liter/térfogat/perc sebességű levegőztetés mellett. Az antibiotikus aktivitást mikrobiológiai vizsgálattal követjük, B. subtilis alkalmazásával, amelyet minimális Davis-í. táptalajon tenyésztünk. 2. példa: Az A 42867 antibiotikum kinyerése Az 1. példa szerint előállított teljes menynyiségű (400 liter) fermentlevet szűrési segédanyag (Hyf!o-FloMaR) alkalmazásával, rotációs szűrőn szűrjük. A szűrt fermentlé pH-ját 2N sósavval 7,5-re állítjuk be; hozzáadunk 1000 ml elő-duzzasztott D-Ala-D-Ala-aminokaproil-Sepharose-4B módosított mátrixot (amelyet a 122969 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírt módon állítottunk elő) és a rendszert egy éjjelen át enyhe kevertetés mellett állni hagyjuk. A gyantát szűréssel kinyerjük és kb. 10 liter 0,5 (tömeg/térf.) %-os HCI-Tris pufferrel (pH 7,5) mossuk, amely 5 (tömeg/térf.) % NaCl-t tartalmaz, majd a mosást 4X5 liter vízzel folytatjuk, a mosófolyadék elöntésével. A szelektive a gyantához kötött terméket 4X5 liter 1,5 (tömeg/térf.) %-os ammóniumhidroxiddal eluáljuk és n-butanollal csökkentett nyomáson végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra (kb. 1800 ml) töményítjük be. A betöményített vizes oldatot liofilizáljuk; így 75,6 g nyers A 42867 antibiotikumot kapunk. 3. példa: A nyers A 42867 antibiotikum tisztítása 75 g, a 2. példa szerint előállított nyers A 42867 antibiotikumot 2 liter, 2M NaCI-t tartalmazó vízben oldunk, az oldat pH-ját 0,1 N nátriumhidroxid oldattal 7,5-re állítjuk be, majd szűrjük. A szűrletet 500 ml/óra sebességgel felvisszük egy 1000mi-es oszlopra (0,1X0,1 m), amely elő-duzzasztott D-Ala-D-Ala-6-aminokaproil-Sepharose-4B módosított mátrixot tartalmaz (ezt a 122969.4 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírt módon állítottuk elő), amelyet előzetesen 0.04M pH 7,5'borát pufferrel hoztunk egyensúlyba, mimellett ez a puffer NaCl-re nézve 2M és 0,6 ml TritonX Xl00-at (Baker minőség) tartalmaz. Az oszlopot 8 liter 8M (pH 7,5) karbamiddal mossuk, 500 ml/óra áramlási sebességgel, majd 70 liter, 10-es pH-ju vizes NaOH- dal, és 1000—1000 ml-es frakciókat szedünk. Ezeket a frakciókat B. subtilis alkalmazásával agar-lemezeken vizsgáljuk. Az inaktív frakciókat elvetjük, míg az aktív frakciókat (jelen esetben ilyen a 63.—70. frakció) egyesítjük, kis térfogatra töményítjük be (500 ml), csökkentett nyomáson, n-butanollal végzett azeotróp desztilláció segítségével, majd liofilizáljuk. így 4 g A 42867 antibiotikumot kapunk. 4. példa: Az A 42867 antibiotikum tisztítása és sómentesítése 3,5 g, a 3. példa szerint kapott A 42867 antibiotikumot 70 ml 2,5 g/liter töménységű nátrium-dihidrogénfoszfát.monohidrát oldat és acetonitril 91:9 arányú elegyében oldunk és az oldatot szűrjük. 10 ml ilyen szürletet feiviszünk egy 2X X50 cm-es saválló acél oszlopra, amelyet 40 g 10 pm RP 18 Lichrosorb fordított fázisú szilikagéllel (Merck) töltöttünk meg. Az oszlop része egy Chromatospac Modulprep egységnek (Jobin Yvon, Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 8 ml/perc sebességgel ugyanazzal az oldattal eluáljuk, amelyet a minta oldására használtunk fel és 50 ml-es frakciókat szedünk. Mindegyik frakciót HPLC-vel és érzékeny mikroorganizmussal, pl. B subtilis-szel, papírkorongos biológiai meghatározás keretében vizsgálunk. A B. subtilis-szel szemben aktív frakciókat egyesítjük, az acetonitrilt csökkentett nyomáson végzett desztillációval eltávolítjuk és 16 9 197769 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
