197769. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-42867 antibiotikum, addíciós sói és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197769 rixokat ír le a 122969 sz. európai szabadalmi bejelentés. A kitüntetett mátrix ebben az eljárásban az ellenőrzött pórusméretű keresztkötéses polidextránnal kapcsolt D-alanil-D-alanin. A szűrt fermentlevet ezután affinitáskromatográfiának vetjük alá rögzített D-alanil-D-alaninon, oszlopon vagy szakaszosan. Az A 42867 antibiotikumnak az affinitás-mátrixhoz való kötését előnyösen kb. pH 7,8— 8,0 értéken végezzük, az eluálást pedig bázisosabb pH-értékeken (előnyösen 9,0—11,5 között) hajtjuk végre, egy vizes bázis jelenlétében. Ez a vizes bázis lehet ammónia, egy illékony amin, egy alkáli- vagy alkálifém-hidroxid vagy egy bázisos pufferoldat, adott esetben egy poláris szerves oldószer — pl. egy, a következőkben meghatározandó poláris, vízzel elegyedő oldószer — jelenlétében. A szennyezéseket úgy távolítjuk el, hogy az oszlopot egy pH 4—8 vizes pufferrel öblítjük át, amely adott esetben sókat, karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket tartalmaz. Az A 42867 antibiotikumot ezután az előbbiekben leírt eluenssel eluáljuk. A nyers antibiotikumot előnyösen úgy nyerjük ki, hogy az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókból teljesen eltávolítjuk a vizet, egy szerves oldószerrel végzett azeotróp desztillációval (amely szerves oldószer képes a vízzel azeotróp elegyeket képezni), majd egy nem-oldószert adagolunk, a keresett termék kicsapására. Jellegzetes példák az olyan szerves oldószerekre, amelyek vízzel minimális azeotróp elegyeket képesek képezni, a következők: n-butanol, benzol, toluol, butiléter, széntetraklorid, kloroform, ciklohexán, 2,5-dimetil-furán, hexán és m-xilol; a kitüntetett oldószer ezek közül az n-butanol. Példák a nem-oldószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek — pl. etiléter, propiléter és butiléter —, valamint a rövidszénláncú alkil-ketonok, pl. az aceton. Egy másik megoldás szerint az egyesített,- antibiotikumot tartalmazó frakciókat kis térfogatra töményítjük be — előnyösen egy, az előbbiekben meghatározott szerves oldószerrel végzett azeotróp desztil lációval—, és a kapott vizes oldatot liofilizáijuk. Ha az elució során alkalmazott vizes bázis nem illékony, kicsapás vagy fagyasztva-szárítás előtt szükség lehet a koncentrátum semlegesítésére és sómentesítésére. Egy célszerű sómentesítési eljárás szerint az antibiotikumot tartalmazó vizes oldatot felvisszük egy szilanizált szitikagél oszlopra; ezt desztillált vízzel mossuk és poláris, vízzel elegyedő oldószer és víz elegyével eluáljuk. Jellegzetes példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre a következők: vízoldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, rövidszénláncú alkánsav-észterek (pl. az etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid 7 és ezek elegyei. A kitüntetett vízzel elegyedő poláris oldószer az acetonitril. Egy másik megoldás szerint a sómentesítést úgy végezhetjük, hogy az antibiotikumot tartalmazó oldatot felvisszük az előbbiekben leírt affinitás-oszlopra, ezt desztillált vízzel mossuk és egy illékony vizes bázissal eluáljuk, amint ezt az előbbiekben az affinitáskromatográfiával kapcsolatos- eluciót illetően leírtuk. Az így kapott termék az A 42867 antibiotikum. Egy célszerű eljárást — tiszta A 42867 antibiotikum előállítására — képvisel az affinitáskromatográfíás oszlopon az előbbiek szerint kapott termék további tisztítása. Általában ugyanazt a stacionárius fázist használjuk, mint az előbbiekben (rögzített D-alanil-D-aianin) és a keresett antibiotikumot ugyanazon affinitáskromatográfiás eljárás szerint eluáljuk, amelyet az előbbiekben, rögzített D-alanil-D-alanin alkalmazása kapcsán leírtunk. Kitüntetett rögzített D-alanil-D-alanin a Sepharose-epszilon aminokaproil-D-alanil-D- alanin; kitüntetett ekvilibráló elegy a NaCI- re 2M, pH 7—8-ra beállított 0,16 (tömeg/térf.) %-os ammónia; kitüntetett öblítő oldat a NaClre 2M, pH 7—8-ra beállított 0,16 (tömeg/térf.) %-os ammónia; kitüntetett eluáló elegy a 0,16 (tömeg/térf.) %-os ammónia. Egy másik megoldás szerint a találmány szerinti antibiotikum erős vagy gyenge anioncserélő gyanták segítségével különíthető el a fermentléből, vagy ezekkel végezhető a további tisztítás; ilyen gyanták a funkcionálisan átalakított polistirol, az akril — vagy polidextrán mátrixok. Néhány gyenge anioncserélő gyanta a következő védjeggyel ellátva kerül forgalomba: Dowex MWA—1 vagy WGR (Dow Chemical); Amberlite IRA—73 (Rohm and Haas); DEAE-Sephadex (Pharmacia). A találmány szerint alkalmazható erős anioncserélő gyanták közül néhány a következő védjeggyel ellátva kerül forgalomba: Dowex MSA—1, SBR, SBR-P (Dow Chemical); Amberlite IR-904 (Rohm and Haas) és QAE-Sephadex (Pharmacia). Az A 42867 antibiotikumnak ezekről a gyantákról való eluálását vizes elektrolit-oldatok lineáris grádiens elegyei segítségével végezzük; ilyen elektrolit a nátrium- vagy káliumklorid, amelyet vízben vagy víz és egy vízzel elegyedő szerves oldószer (ilyen pl. egy rövidszénláncú alkohol, amilyenek az 1 — 4 szénatomos alkanolok vagy egy rövidszénláncú alkil-keton, amilyen pl. az aceton, metil-etil-keton) elegyében oldunk. Az A 42867 antibiotikum fizikokémiai jellemzői 8 A) Az 1. ábrán bemutatott UV abszorpciós spektrum, amelyben a következő abszorpciós maximumok találhatók: lambdamor (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) víz 282 c) pH 7,4 foszfát puffer 282 b 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
