197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 hatásfoka (104 rekombináns/pg cDNS) sokkal kisebb, mint a lambda-technikáé (106 rekombinánsig/pg cDNS) A hibridizációs vizsgálati minták előállítása Radioaktiv jelzett vizsgálati mintákat szintetizálunk primerként különböző DNS fragmenseket alkalmazó módszerrel, borjú timusz DNS denaturált véletlenszerű prímért alkalmazva (Hudson, P., Haley, J., John, M., Cronk M., Crawford, R., Haralambidis, J., Treagar, G., Shine, J. és Niall, H.: Nature, 301, 628— 631 (1983); Taylor, J.M., IUrnersee, R. és Summers, J.: Biochem. Biophys. Acta 442, 324— 330 (1976)). A DNS templátnak (100— 200 ng) a véletlenszerű primerekkel együtt történő denaturálást 20 pl vízzel való forralással végezzük. A szintézist 30 pl következő összetételű reakciókeverékkel indítjuk be: 50 mmól/liter Tris-HCl, pH 8,0, 50 mmól/li ter NaCl, 1 mmól/liter DTT (ditiotreitol), 10 mmól/liter MgCl2, 5 egység E. coli DNS polimeráz 1 (Klenow-fragmens), egyenként 500 pmól/liter dCTP, dGTP, dÍTP és 0,3 pmól/literoc- [32P] -dATP (mintegy 3000 Ci/mmól, Amersham gyártmány). 37°C hőmérsékleten 30 percen át történő inkubálás után a reakciót 300 pl, következő összetételű pufferral történő hígítással fejezzük be: 0,3 mól/liter NaCl, 10 mmól/liter Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmól/liter EDTA. A reakciókeveréket Sephadex — G 50 oszlopon (1 cm X 5 cm) visszük át azonos pufferban. A rádióaktivan jelzett, az üres térfogatnak megfelelő vizsgálati mintákat a csúcsfrakciókból összegyűjtjük, és 2 térfogat etanollal, —20°C hőmérsékleten két órán át tartva kicsapjuk, 10 pg tRNS-t használva hordozóként. Fajlagos cDNS kiónok kiválasztása A humán petefészek cDNS klón-bank átrostálásához a relaxinra fajlagos szekvenciák szempontjából vizsgálati mintaként a korábban azonosított Hl gén egy szegmensét alkalmazzuk, amely szegmens a C pepiidet, a 64. aminosavtól számítva az A láncot (a befejező kodonon át) és a 3’ le nem fordított terület 80 bázisát kódoló 400 nukleotidos szegmensnek felel meg. Egyetlen pozitív cDNS- klónt izolálunk és vetünk alá szekvencia-analízisnek a pBR 322 „könyvtáriból 23 egyedi rekombinánst izolálunk a ^GT10 könyvtárból, de ezek közül csak hatot vetünk alá teljes nukleotid szekvencia analízisnek. DNS szekvencia analízis A szekvencia-megállapítás stratégiája és a cDNS kiónok rövidített restrikciós térképe az 1. ábrában van összefoglalva. A pBR 322 rekombináns plazmidot Hpa II (P), Hinf 1(F) vagy Tal(T) restrikciós enzimekkel emésztjük és reverz transzkriptázt és a megfelelő a-jelzett dezoxinukleotid trifoszfátot (dCTP a Hpa II-höz és a Taq I-hez, dATP a Hinf I-hez) alkalmazva a végén jelzéssel látjuk el. A frag- 8 13 menseket belsőleg elhasítjuk egy második restrikciós endonukleázzal, majd elektroforézissel, 8% poliakrilamid gélen elkülönítjük, mielőtt Maxam és Gilbert kémiai lebontási módszerével (Maxam, A.M. és Gilbert, W.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560—560 (1977)) a szekvencia-analízist elvégeznénk. A XGT10-ben levő cDNS kiónok szekvencia-analízisét EcoRl restrikciós fragmens M13mp9-be történő szubklónozásával és Sanger és munkatársai által leírt technika alkalmazásával (Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B.G., Smith, A.J.H. és Rose, B.A.: J. Mol- Biol. 143, 161 — 178 (1977)) végezzük. Southern és Northern gél analízis Ezt a módszert tisztított genom DNS-en hajtjuk végre restrikciós endonukleáz hasítás után Southern (Southern, E.M.: J. Mól. Bioi. 98, 503—517 (1975)) módszere szerint, vagy tisztított RNS-en. A DNS fragmensekről, amelyeket vizsgálati mintaként használtunk, úgy találtuk, hogy fajlagosak a Hl genom klón exon I-ére vagy exon 11-jéré annak ellenére, hogy csak kis mennyiségű szegélyező szekvenciával rendelkeznek. Ezeket a fragmenseket az exon I vizsgálati minta esetében MT7 klón 500bp-s Alu I fragmensének, az exon II vizsgálati mintához 400 bp-s EcoRl-AVA II fragmensének M13mp8-ba történő szubklónozásával hoztuk létre. Egy H2 cDNS kiónból származó vizsgálati mintát hozunk létre Hinf I-el emésztve és egy 300 bp-s dublettet izolálva, amely az Asp 1-től a befejező kodonig terjedő kódoló területnek felel meg és magában foglalja a 3’ le nem fordított terület 110 bá zisát (1. ábra). Az oligonukleotid vizsgálati mintákat Beaucage és Caruthers (Beaucage, S.L. és Caruthers, M.H.: Tetrahedron Lett. 22, 1859—1862 (1981)) foszfit-kémiai módszerével szintetizáljuk és T4 polinukleotid kinázt használva y-2P-ATP-vel vég-jelzéssel látjuk el. A hibridizációs körülményeket a G-j-C tartalom alapján kalkuláljuk. A H2 genom klón izolálása és nukleotid szekvencia analízise A Lawn és munkatársai szerinti (Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C., Blake, G. és Maniatis, T. 1978) humán genom lambda „könyvtársat átrostáljuk Hudson és munkatársainak (1983) korábban már leírt módszerével (Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. és Niall, H.: Nature, 291, 127—131 (1981)), azzal a különbséggel, hogy a Hl genom klón exon I-ének és exon Il-jének megfelelő DNS fragmensek keverékét alkalmazzuk a vizsgálati mintához, ahogyan ezt fentebb leírtuk. Pozitív fágokat növesztünk egy literes méretarányú folyadék-tenyészetben, a DNS-t izoláljuk és restrikciós endonukleázokkal emésztjük, mielőtt az exon I-el és exon II vizsgálati mintákkal térképeznénk. Egy 4 kilobázisos EcoRl fragmensről úgy találjuk, hogy tartalmazza a teljes exon I kódoló területet, amely megkülönbözteti ezt a kiónt a homo-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
