197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
lóg Hl gén-szerkezettől. Ezt a fragmenst szubklónozzuk M13mp8-ban, és Maxam és Gilbert (1977) korábban idézett technikájával szekvenciáját meghatározzuk. Ava I-el történő emésztés után a kódoló területet átívelő fragmenseket végjelzéssel látjuk el, és belsőleg hasítjuk egy második restrikciós enzimmel (Hpa II vagy Hinf I), hogy a szekvencia analízishez alkalmas fragmenseket hozzunk létre. Egy cDNS klón izolálása Méhenkívüli terhességben történő sebészeti beavatkozás eredményeként vagy császármetszéssel egyidejűleg elvégzett sárgatest-metszésből származó emberi sárgatest-mintákból indulunk ki. Egy egyedi sárgatestből izolált RNS-ből egy cDNS „könyvtársat konstruálunk pBR 322-ben,, mintegy 300 egyedi rekombinánst szolgáltatva. Ezt a „könyvtársat rostáljuk át egy Hl-cDNS vizsgálati mintával, és egy egyedi rekombinánst mutatunk ki a humán relaxin I-re szekvenciahomológiával. Hogy a rekombinánsok teljes számát növeljük ilyen kis mennyiségű petefészek szövetből, egy másfél cDNS „könyvtársat konstruáljuk, ÍGT10 klónozó rendszert használva (Huynh és munkatársai, korábban idézett munka, 1983). Egy relaxinra fajlagos vizsgálati mintával átvizsgálva 23 egyedi cDNS kiónt azonosítunk, amelyből hatot jellemzőnk, amint ez az 1. ábrában látható. A nukleotid szekvencia analízis feltárja, hogy mind a hat cDNS rekombináns ugyanazt a relaxin strukturgént kódolja (2. ábra), ez a szekvencia mégis különbözik a korábban leírt genom kióntól (Hudson és munkatársai, korábban idézett munka, 1983). Az várható, hogy ez az új szekvencia a második humán relaxin génnek (H2) felel meg, amely a genom DNS-ben megfigyelhető volt. Meglepő módon azonban a cDNS kiónok egyike sem tartalmaz poliadenozin szekvenciát a 3’ végnél, bár a cDNS kiónok mérete a pBR 322-ben és MjT10-ben (1800 bp, illetve 1900 bp) jelzi, hogy nagy transzkripciós termékek szintetizálódtak a klónozó eljárás folyamán. Ez a két. cDNS klón átfedő szekvencia azonossággal bír a 3’ terminálisnál, igazolva, hogy ezek azonos mRNS szerkezetből származnak. A poli-A farok hiányát vagy a kettős-szálú transzkripciós reakció idő előtti befejezésének, vagy a klónozó folyamat során történő túlzott SÍ nukleázos bomlásnak tulajdonítjuk. A második génnek megfelelő klón izolálása A Lawn és munkatársai (1978) szerinti humán genom „könyvtáriból nyert 108 rekombináns fág teljes átvizsgálása után a Hl exon I-ére vagy exon Il-jére fajlagos kevert vizsgálati mintákat alkalmazva 16 pozitív fágot találunk. Egy kis méretű restrikciós térkép analízis kimutatja, hogy ezekből a rekombináns fágokból 14 felel meg a korábban leírt Hl relaxin génnek (11 azonos a XW7 genom 15 kiónnal, 3 azonos a AH5-tel, amely a Hudson és munkatársai (1983) által korábban leírt Hl géntől különböző genom klón). A másik két rekombináns fág azonban azonos, és a H2 relaxin gén egyedi restrikciós minta jellemzőivel rendelkezik, amelyeknek szerkezete az 1. ábrában látható. A rekombinánsok szokatlan aranya vagy az eredeti genom „könyvtáriban levő arányokat, vagy az amplifikálás során történő szelektív növekedés eredményét tükrözi. Ennek az új rekombináns fágnak (ÁH 11) Southern folt analízise, a KYi7 klón vagy exon I-ének, vagy exon Il-jének megfelelő különböző vizsgálati mintákat használva, kimutatja, hogy a XH11 csak exon I kódoló területet tartalmaz. Azok a kísérletek, hogy a H2 relaxin génnek megfelelő teljes hosszúságú genom kiónt találjunk vagy a Lawn és munkatársai (korábban idézett munka, 1978) szerinti „könyvtáriban, vagy egy másik „könyvtáriban (Dr. R. Crawford, nem publikált közlés), mindezideig eredménytelenek voltak. A AH11 relaxin-kódoló területének nukleotid szekvenciája azonos azzal, amelyet a cDNS kiónban megfigyeltünk és az 2. ábrában ábrázoltunk. Egy intron szakítja meg a kódoló területet éppen annál a helynél, mint a XH7 genom kiónban (Hudson és munkatársai, korábban idézett munka, 1983), azt a feltételezést helyezve előtérbe, hogy ezek a gének az evolúció ugyanannál a pontjánál alakultak ki gén kettőződési eseménnyel. Northern gél analízis Méhenkívüli terhességben történő sebészeti beavatkozásból vagy császármetszésből nyert humán sárgatest különböző mintáiból RNS-t izolálunk. Kísérleti mintákat használva Northern gél analízist végzünk valamelyik relaxin gén kódoló területéből, és arra a megállapításra jutunk, hogy két fő mRNS fajta, mintegy 1000 bp-s és 2000 bp-s méretű, van jelen a megvizsgált öt emberi petefészek RNS mintában (3. ábra). A kisebb mRNS fajta 2—3- szor több a megvizsgált RNS mintákban és ez az eredmény független attól, vajon az analízisben alkalmazott kísérleti minta Hl vagy H2 relaxinnak felel-e meg, jelezve, hogy nagy kereszt-hibridizációs hányad fordul elő kísérleti körülményeink között. Hogy megkülönböztessük, vajon ez a két mRNS fajta a Hl és H2 gének elkülönített termékeit képviselik-e, oligonukleotid vizsgálati mintákat szintetizálunk a két relaxin gén közti minimális homológja (60%) területéről (137—144 gyökök a 2. ábrában). Ezeket a szintetikus 25 tagú elemeket radioaktív jelzéssel látjuk el kináz és v-32 P-ATP segítségével, és ezeket használjuk hibridizációs kísérleti mintaként a bemutatott körülmények között, Hl vagy H2 génekre fajlagosságot adva. Az ezeket a radioaktivan jelzett vizsgálati mintákat használó Northern gél analízis feltárja, hogy mindkét mRNS fajta a H2 gén termékeinek felel meg. Fajla-16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
