197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
Az egyes aminosavakhoz használt rövidítések a következő táblázatban láthatók: Fenilalanin (Phe) Hisztidin (His) Leucin (Leu) Izoleucin (Ile) Metionin (Met) Valin (Val) Szerin (Ser) Prolin (Pro) Treonin (Thr) Alanin (Ala) Tirozin (Tyr) Minden három Glutamin (Gin) Aszparagin (Asn) Lizin (Lys) Aszparaginsav (Asp) Glutaminsav (Glu) Cisztein (Cys) Triptofán (Trp) Arginin (Arg) Glicin (Gly) betűs kódon (más néven •dezoxinukleotid triplet vagy nukleotid triplet), amely a táblázatban megtalálható (pl. AUG, CAU) egy mRNS trinukleotidnak felel, meg, az 5’ véggel a bal és 3’ véggel a jobb oldalon. A betűk purin vagy pirimidin bázisokat jelentenek, amelyek a nukleotid szekvenciát alkotják. Minden itt megadott DNS szekvencia a szálnak az a DNS szekvenciája, amely megfelel az mRNS szekvenciának, csak éppen timinnel (T) helyettesítve az uracilt (U). Az ezt követő részletes tárgyalásban utalások lesznek az ábrákra, az ábrák a következők: Az 1. ábra a pBR 322-ben, Hll genom-klónban és GT lO^cDNS kiónokban (a-f) levő cDNS klón rövidített restrikciós térképét és szekvencia meghatározásának stratégiáját mutatja be. Nyilak jelzik a szekvencia meghatározás irányát a vég-jelzett fragmenseken (lásd a módszereknél). A GT 10 kiónok (a-f) szekvenciáját egy M 13 vektorba való szubklónozással határozzuk meg, amint ezt később leírjuk. A nukleotidokat az AUG indító kodonlól (1.—3. hely) számozzuk a vég-kodonig (554.-556. hely). A 2. ábra a H2 humán preprorelaxin (fent) aminosav- és mRNS szekvenciáját hasonlítja össze a megfelelő H1 (lent) szekvenciával. A szekvenciák úgy vannak sorrendbe állítva, hogy bemutassák a csillaggal jelzett maximális nukleotid-azonosságokat és a keretbe zárt területeken kívüli aminosav-homológiákat. Az aminosavak számozása a B-lánc elejétől kezdődik (a H2 gén-szekvencia a -1-nél és a Hl szekvencia a -4- 1-nél kezdődik), bár ez a hely a B lánc szekvenciája kezdetének csak feltételezett helyét reprezentálja és egyszerűen csak hasonló sertés és patkány preprorelaxin szerkezetek homológiája alapján van kikövetkeztetve. A csillag a 45. helyen levő Alá alatt a C peptidben egy intron helyét jelzi a G/CA kodonban mindkét génben. A 3. ábra azonos nitrocellulóz csíkok autoradiográfiáit tartalmazza vagy az a.) humán petefészek RNS Northern gél transzferjéből vagy b.) a Hl génnek (MH7) vagy H2 génnek (XGT10-a) megfelelő A-plakkokból véve, hibridizációs mintaként A: egy véletlenszerűen beindított 600 bp-s H2 relaxin cDNS fragmenst; B: H2-fajlagos 25 tagú szakaszt (483— 507); C: Hl-fajlagos 25 tagú szakaszt (483— 507); D: Hl-fajlagos 25 tagú szakaszt (248— 272) alkalmazva. A 4. ábra a humán petefészek RNS Northern gél transzferjét követő azonos nitrocellulóz csíkokat tartalmazza, hibridizációs vizsgálati mintaként a pBR 322-ben levő H2 cDNS 5 klón fragmenseit alkalmazva (lásd 1. ábra). A: 600 bp fragmens (72—660), amely a kódoló terület legnagyobb részének felel meg. B: 5’ le nem fordított terület (Hinf I helyig a 30. nukleotidnál) W C: 3’ le nem fordított terület (Hinf I. helytől a 660. nukleotidnál) D: 3’ le nem fordított terület (Hpa I. helytől a 850. nukleotidnál) Az 5. ábra a két humán relaxin gén, a hu- 15 mán inzulin és a relaxin család más tagjai A és B láncai aminosav-szekvenciáinak összehasonlítását tartalmazza. A bekeretezett területek kihangsúlyozzák azokat a maradékokat, amelyek megegyeznek a két humán relaxin 20 gén és más relaxinok esetén. A nyilak jelzik a proteolitikus hasítás valószínű helyeit a sertés (Schwabe, C. McDonald, J.K. és Steinetz, B.C.: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 75, 503—510 (1977); James, R., Niall, H., Kwak, 25 S. és Bryant-Greenwood, G.: Nature, 267, 544—546 (1977)), patkány (John, M.J., Walsh J.R., Borjesson, B.W. és Niall, H.D.: Endocrinology 108, 726—729 (1981)); cápa (Schwabe G., Gowan, L.K. és Reinig, J.W.: Ann. N.Y. 3q Acad. Sei. 380, 6—12 (1982)) és macskacápa (Schwabe és munkatársai, 1983. megjelenés alatt) A és B láncai aminosav-terminális maradékainak fehérje-szekvencia adatai alapján. A H2 mRNS 2. ábrában bemutatott szek- 35 venciáját a később leírt módszer szerint határozzuk meg. Az összehasonlítás megkönnyítése érdekében a Hl szekvenciából származó peptidekhez korábban használt aminosavak számozását megtartottuk a H2-eredetű pepti- 40 dek jelen leírásában. A Hl-preprorelaxin szerkezetét a genom-szekvenciából következtettük ki a sertés és patkány relaxin homológ szerkezetével összehasonlítva. A H2-preprorelaxin szerkezetét a Hl szerkezettel való, valamint a sertés- és patkány relaxinnal való összehasonlítás segítségével következtettük ki. Az A és B pepiid lánc szerkezet bizonyítását szintézissel és in vitro lánc-rekombinációval végeztük, olyan anyagot állítva elő, amely bio- 50 lógiailag aktív a méh összehúzódási vizsgálatokban. A 2. ábrából kitűnik, hogy a jelen és a korábbi szekvenciák szignifikáns különbségeket, de azonosságokat is mutatnak. A különösen 55 megjegyzésre méltók: (1) Szignifikáns aminosav különbségek a három fő területen, a. ) a B-lánc N-terminálisa b. ) az A-lánc N-terminálisa c. ) a C-peptid közepe 60 (2) A határozott homológia területei a B-láncban és a C-peptidben: a. ) 120 azonos bázis a Val6-tól áz Ile47-ig b. ) 88—90 azonos bázis Phe10l-től Ser132-ig A két gén tehát nagyon hasonló, de a kü-65 lönbségek elegendők annak jelzésére, hogy 6
