197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 a H2 gén egy második gén és nem csupán a Hl polimorf módosulata. A Hl preprorelaxin in vitro termelésének módja még nem teljesen ismert, de a sertés relaxinról a szignál pepiid lehasításának analógiája alapján az a valószínű, hogy ez a hasítás az Ala_lLys_1 kötésnél történik. Hasonlóképpen valószínűsíthető, hogy a Hl C:peptidjének hasítása a Leu32—Ser33 és az Arg - Arg137 helyen történik, így adódik ki a Hl-B lánc 32 és a Hl-A lánc 24 gyökkel. (2. ábra) A H2 preprorelaxinban az Alá-1 Asp-val van helyettesítve, és így megjósolhatjuk a szignál peptid lehasítását a Hl-ben -2 helynek megfelelő alanin után. A H2—B lánc/C peptid kapcsolódásnál a hasítás a Leu32 után várható az összes más prorelaxin analógiája alapján, így a H2-B láncra 33 maradék adódik. A H2-C peptid/A lánc kapcsolódásnál hasítás az Arg136 után történhet a patkány preprorelaxin analógiája alapján, így a H2-A láncra 24 maradék adódik. Amint a sertés relaxinnal kapcsolatos vizsgálatainkban megfigyeltük, a sertés relaxin B és A láncainak vannak olyan lényeges belső szekvenciái, amelyek a biológiai aktivitás öszszes lényeges elemét tartalmazzák. A humán relaxin lánc szintézisével kapcsolatos tanulmányaink hasonló eredményeket mutatnak, amint ez későbbi részletes ismertetésünkből kiderül. A jelen találmány egyik tárgya tehát egy olyan gén előállítása, amely a humán H2 prepprorelaxint fejezi ki. Hacsak másképpen nem jelezzük, minden ez után következő preprorelaxinhoz, prorelaxinhoz és relaxinhoz, valamint szignál A, B és C peptidekhez tartozó génszekvenciára, valamint magukra a peptidekre vonatkozó utalás a H2 variánsokra vonatkozik, a Hl variánsok kizárása mellett. Részletesebben a jelen találmány egyik tárgya egy olyan kettős szálú DNS fragmens, előállítási eljárása, amely humán preprorelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak a teljes mRNS szekvenciának (—25-től 160-ig terjedő kodonok) felel meg, amely a 2. ábrában látható. A találmány magában foglalja az itt leírt H2-preprorelaxin gén bármilyen alegységét vagy az említett szekvencia vagy alegység bármilyen ekvivalensét. Az említett alegységek között vannak azok az egyedi strukturgének, amelyek a humán preprorelaxin szignál peptid láncát és külön-külön H2-A és H2-B peptidjeit és a H2-C láncot kódolják (lásd 2. ábra), és ezeknek a láncoknak bármiféle kombinációit. Ilyen kombináció lehet pl. egy H2-A és H2-B peptid láncot elkülönítve vagy preprorelaxin-szerűen (vagyis H2-C lánccal összekapcsoltan) kifejező gén. Az alegységek szintén magukban foglalják az említett gén-szekvenciák bármelyikének fragmenseit és fragmens-kombinációit. 7 A jelen találmány egy másik tárgya egy olyan gén előállítása, amely a humán proprerelaxint fejezi ki. Részletesebben a jelen találmány egyik tárgya egy kettős szálú DNS fragmens, előállítási eljárása, amely humán proprerelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak a kodonnak felel meg, amely 1 —160 számmal látható a 2. ábra szerinti mRNS szekvenciában. A jelen találmány további tárgya olyan gének előállítása, amelyek elkülönítetten ki tudják fejezni a humán relaxin A, B és C láncait, vagy az említett láncokból kettőnek vagy többnek a kombinációját, vagy az említett láncok fragmenseit vagy fragmens-kombinációit. Részletesebben a jelen találmány tárgya kettős szálú DNS fragmensek előállítása, amelyek elkülönítetten tudják kifejezni a humán relaxin A és/vagy B és/vagy C láncait (vagy azok fentebb leírt fragmenseit), és amelyek a 2. ábrában látható mRNS szekvenciák —1-32, 33—136, és 137—160 számai közti kodonjainak megfelelő kódoló szálat és egy komplementer szálat tartalmaznak. A fentebb leírt gének a fajlagos kodonon kívül magukban foglalhatják a megfelelő „start" és „stop" kodonokat is, vagyis az AUG t és UGA-t (—26 és 161 kodonok a 2. ábrán). A szakmában járatosak tisztában vannak azzal, hogy a géneknek polimorf módosulatai is lehetnek. Az ilyen módosulatok is beletartoznak a találmány körébe. A találmány magában foglalja a fenti szekvenciák komplementerjeit és az alegységeket vagy ekvivalenseket is, valamint a megfelelő RNS szekvenciákat, alegységeket vagy ekvivalenseket. A jelen találmány egy további tárgya egy DNS transzfer vektor előállítása, amely a fentebb meghatározott génnek megfelelő dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazza. Amint fentebb láttuk, a genetikai kód tartalmaz redundanciákat, vagyis bizonyos aminosavakat több, mint egy kodon kódol. Ennek megfelelően a találmány magában foglalja azokat a dezoxinukleotid szekvenciákat is, amelyekben az ábrákban bemutatott kodonok vagy cDNS ekvivalensei más kodonokkal vannak helyettesítve, olyan kodonokkal, amelyek szintén tudják kódolni ugyanazt az aminosavat. Továbbmenve, amint ezt korábban jelezük, relaxin aktivitással rendelkező peptideket lehet előállítani, amelyek a B és/vagy A lánc szerkezetében különböznek a természetes relaxintól. Az ilyen eltérések maguk után vonhatják egy vagy több aminosav törlését (delécióját) és/vagy további aminosavak hozzátételét és/vagy különböző aminosavak helyettesítését a természetes láncban. így a találmány magában foglal olyan géneket és DNS transzfer vektorokat is, amelyekben — ahogyan ezt korábban leírtuk — egy vagy több természetes kodon törölve van 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
