197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
vettenyésztő lombikok újraoltására. Azokat a sejteket, amelyek nem mozdultak,, ki ellátjuk friss RPMI-1640 tápközeggel. Ezen a módon 5 hónap teljes időtartam alatt a szérumtól független Bowes II sejtvonal tenyészete létrejön. b.) Bowes II sejtvonal létrehozása Bowes I sejtekből gyűjtött kondicionált tápközeg nélkül 4 ml Bowes-RPMI 7272 szérum-függő melanoma sejtvonal fagyasztott tenyészetet, amely 15% borjúembrió szérumot és 10% DMSO-t tartalmaz, felengedtetjük és hozzáadjuk 15 ml szérummentes, előmelegített DMEM-hez 75 cm2 * *-es szövettenyésztő lombikban. A sejteket egy éjszakán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten nedves atmoszférában, amely 5% széndioxiddal van kiegészítve. Ez után az idő után a teljes tápközeget, beleértve a nem tapadó sejteket is, eltávolítjuk és 15 ml szérummentes DMEM-mel helyettesítjük. Az inkubálást addig folytatjuk, amíg a sejtek szemcsézettnek tűnnek mikroszkóp alatt (24—72 óra); ennél az időpontnál a tápközeget eltávolítjuk és friss szérummentes DMEM-mel helyettesítjük. Ezt az eljárást megismételjük minden 2—3 napon, ahogy szükséges (a sejtek mikroszkópos megjelenése, a tápközeg pH változása), fokozatosan növelve a tápközeg össztérfogatát 30 mire. Amikor 60—70% összefolyást érünk el (mintegy 3 hét), a sejteket két új, azonos méretű lombikba visszük át 0,02% EDTA-t alkalmazva, hogy a sejtek a tenyésztő edény felületéről leváljanak. Az első átoltásnál a szérummentes DMEM tápközeget kiegészítjük 40% olyan tápközeggel, amelyet a tenyészetből távolítottunk el az EDTA kezelés előtt. Ennél a pontnál a szérummentes vonal kialakul és a sejtek folytatják az osztódást kondicionált tápközeg távollétében is, ha megfelelően nagy sejtsűrűséget tartunk fenn, pl. legalább 30% összefolyásnál. 2. példa Bowes II sejtek tenyésztése süllyesztett tenyészetben Szövettenyésztő lombikban, szérummentes RPMI-1640 tápközegben összefolyásig nőtt Bowes II sejteket kimozdítjuk a lombik kézzel végzett erőteljes megcsapolásával, összegyűjtjük a sejteket, hogy 0,6 1 szuszpenziót kapjunk, amely 2.105 sejtet tartalmaz milliliterenként, .és ezt a szuszpenziót átviszszük 3 1-es, gőzzel sterilezett üvegedénybe. A sejtszuszpenziót lassan kevertetjük mechanikus keverővei (40 fordulat/perc). A hőmérsékletet szabályozzuk 37±0,l°C-ra és a tenyészetet ellátjuk oxigénnel felületi levegőztetés segítségével 0,2 1/perc sebességgel, az alkalmazott levegő 5% C02-t tartalmaz. A pH csökkenését 6,9 alá megakadályozzuk tiszta levegőre visszatérítéssel. A mintegy egy hetes kezdeti adaptációs periódus során friss, szérummentes tápközeget adunk, hogy meg-11 akadályozzuk a glükóz kimerülését. A végső tenyésztő térfogat 1 liter. Amikor a sejtsűrűség eléri a 3—4.105 * sejt/ml-t, megkezdődik a tenyészfolyadék periodikus kivonása. Minden 2—4 napon a kevertetést 3 órára félbeszakítjuk, hogy lehetővé tegyük hogy az élő sejtek leülepedjenek, és az elhasznált tápközeg felső 30%-át kivonjuk, és friss, szérummentes tápközeggel helyettesítjük. A tenyészfolyadékot 2000 fordulat/perccel (~300 g) 5 percig centrifugáljuk, hogy a teljes sejteket és a sejttörmeléket eltávolítsuk. A.z oldatot Triton X-100-zal stabilizáljuk, 0,1 % végső koncentrációt alkalmazva, és ecetsavval savanyítjuk 5,5—6,0 pH értékre, mielőtt —20°C hőmérsékleten tárolnánk. 3. példa Bowes II sejtek tenyésztése szövettenyésztő lombikban és a tenyészfolyadékok összegyűjtésére A Bowes II szérumtól független sejtvonalat 5.107 sejt/150 cm2 szövettenyésztő lombik (Costar) mennyiségében inokuláljuk 50 ml antibiotikumokkal kiegíszített RPMI tápközegbe (lásd 1. példa) 37°C hőmérsékleten nedves atmoszférában, amely 95% levegőből és 5% C02-ből áll. Amikor a sejtek tapadóvá váltak, a tápközeget a sejtekből összegyűjtjük és friss, antibiotikumokkal kiegészített RPMI-1640 tápközeggel helyettesítjük. A szérummentes tenyészfolyadék kiemelését 24 órás időtartamonként ismételjük, amíg az egy-réteg összefolyása szükségessé teszi az átoltást. Az összefolyást mintegy 5 hét múlva érjük el. A tenyészfolyadékot úgy dolgozzuk fel, ahogyan ezt a 2. példában leírtuk. 4. példa Megnövekedett TPA szint előállítására képes szérumtól független Bowes II sejtvonal mutáns kiválasztása 5% borjúembrió szérumot adunk szérumtól független Bowes II sejtvonal Petri-csésze tenyészetéhez abból a célból, hogy növeljük a sejtek növekedési sebességét és biztosítsuk, hogy több sejt legyen a fázisban egy adott időpontban. Amikor a sejtek gyorsan osztódó és exponenciálisan növekvő fázisban vannak, és amikor ezek mintegy 70%-os öszszefolyásánál vannak, 0,1 mmól/1 N-metil-N-nitro-N’-nitroguanidint (MNNG) adunk a tenyészethez. Ez a koncentráció a sejtek 70—80%-ának pusztulását okozza. 36 óra múlva a megmaradó élő sejteket a Petri-csészéről tripszinezéssel eltávolítjuk. A sejteket újra átoltjuk 1.105 sejt/60 mm Petri-csésze sűrűséggel. Két hét múlva sejtek telepeit figyeljük meg a csésze fenekénél, minden telep egyedi sejtek utódait képviseli, amely sejtek túlélték a mutagenezíst. Ezeket a telepeket azután 1 ml fedő oldattal fedjük, amely az alábbiakat tartalmazza: 50 pl plazminogén (1 mg/ml), 300 pl 8% -os kazein izotóniás sóoldatban, 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
