197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
9 197766 don is, hogy gázáramot viszünk át a tenyészeten keresztül. A szérumtól független humán sejtekből, pl. Bowes II sejtekből kapott tenyészfolyadékokat centrifugálni kell, hogy eltávolítsuk a levált sejteket és a sejttörmeléket. Ajánlatos nem ionos detergenseket adni a tápközeghez, hogy megakadályozzuk a TPA, pro-TPA és a sejtek által kiválasztott más értékes anyagok adszorpcióját az edény felületére, és így megóvni az enzimaktivitást. A nem ionos detergenst, pl. a Triton X-100-at vagy Tween 80-at előnyösen mintegy 0,01—0,1% koncentrációban adjuk hozzá. Mivel a legnagyobb aktivitás 5,5-6,0 pH értéknél marad fenn, a tenyészfolyadékot gyenge savval, úgymint kis szénatomszámú alkánkarbonsavval, pl. ecetsavval savanyítjuk erre a pH-ra a kis hőmérsékleten végzett tárolás előtt, ez a hőmérséklet pl. 4°C 48 órára, vagy hosszabb időtartamra —20°C. Az alábbi példák a jelen találmány illusztrálására szolgálnak, de nem azért alkottuk meg ezeket, hogy korlátozzák a találmány oltalmi körét. Kísérleti rész A kísérleti részben alkalmazott rövidítések BPT1 bázisos pankreász tripszin inhibitor BSA szarvasmarha szérum albumin. DFA diizopropil-fluorofoszfát DMEM Dulbecco által módosított Eagle tápközeg DTT 1,4-ditiotreitol EDTA etilén-diamin-tetraecetsav FCS borjúembriószérum PBS foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat (8 mmól/1 Na2HP04; 1,5 mmól/1 KH2PÓ4; 0,14 mól/1 NaCl; 2,7 mmól/1 KCI) RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute 1640. tenyésztő tápközege SDS nátrium-dodecil-szulfát TCA triklór-ecetsav írisz írisz-(hidroxi-metil)-amino metán T-T(0,1) 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH 8,1), amely 0,1% Triton X-100-at tartalmaz 1. példa A Bowes II szérumtól független sejtvonal megalkotása a.) A Bowes II sejtvonal megalkotása Bowes I sejtekből gyűjtött kondicionált tápközeg segítségével Humán melanoma sejtvonalat [Bowes-RPMI 7272, amelyet Rijken D. C. és Collen D. írtak le: J. Bioi. Chem. 256, 7035—7041 (1981)] kaptunk Dr.Reich E.-től (Rockefeller University, New York). A sejtvonalat szövettenyésztő lombikban (150 cm2, Costar) tenyésztjük 37°C hőmérsékleten nedves atmoszférában, amelynek összetétele 95% levegő és 5% C02. A sejtek tapadó egy-rétegként nőnek Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 tápközegen (Gibco) amely 6 az .alábbiakkal van kiegészítve: 2 g/l nátrium-bikarbónát, antibiotikumok (300 pg/ml penicillin; 200 pg/ml sztreptomicin; 10 pg/ml tilocín), és 10% hővel inaktivált (56°C; 30 perc) borjúembrió szérum (FCS). Egy szövettenyésztő lombikot, amely sejtek tapadó egy-rétegét tartalmazza, kiválasztunk. Az összefolyásnál a szérumot tartalmazó tápközeget eltávolítjuk és 50 ml RPMI-1640 tápközeggel helyettesítjük, amely antibiotikumokkal van kiegészítve (lásd fentebb). További adalékok nincsenek ebben a tápközegben. A sejteket 37°C hőmérsékleten tartjuk nedves levegő atmoszférában, amely 5% C02-vel van kiegészítve. A tápközeget 24 órás időközönként cseréljük. Kezdetben a sejtek egészségesnek tűnnek és tapadók maradnak. 12 nap múlva a sejtek kezdenek leválni a tenyésztő edényről és szabadon lebegnek a tápközegben. 14 nap múlva a sejtek többsége leválik és az élő sejteknek egy kis frakciója még marad a lombikhoz rögzítve. A levált sejteket tartalmazó tápkőzeget eltávolítjuk. A melanoma sejtek gyéren tapadó tenyészetét, amelytől a szérumot ismételt időtartamon át megvontuk, 50 ml új tápközeggel fedjük le, amely tápközeg „kondicionált tápközeg”-et tartalmaz azonos térfogatú RPMI-1640-nel hígítva. A „kondicionált tápközeg"-et az alábbiak szerint kapjuk. Szérumot tartalmazó tápközeget távolítunk el Bowes-RPMI 7272 összefolyó szérumfüggő melanoma sejtjeiről és kizárólag RPMI-1640 tápközeggel helyettesítjük. 24 óra múlva ezt a tápközeget kinyerjük, 2000 g'-nál centrifugáljuk 5 percen át és átengedjük 0,45 pos Millipore szűrőn. Az így létrejött oldatot nevezzük „kondicionált tápközeg"-nek és ezt közvetlenül hígítjuk azonos térfogatú RPMI-1640-nel. Friss RPMI-1640-nel hígított kondicionált tápközeget adunk a tenyészethez 3—4 napos időközönként 3 hónapon keresztül. Ez után az idő után a sejtszám jelentősen növekszik és a szérummentes tápközeg tovább már nem igényel kondicionált tápközeget. A tenyészetet ezután kizárólag RPMI-1640-nel tápláljuk. Az így kapott, szérumtól független sejteket szövettenyésztő lombikban (150 cm2, Costar) tenyésztjük, ezt mintegy 106 sejt/mí tápközeg sűrűséggel oltjuk be, hogy biztosítsuk a túlélést. A sejteket tipikusan 5.107 sejt/50 ml RPMI-1640/150 cm2 lombik menynyiségben oltjuk. A sejtek nagyon lassan nőnek a szérummentes tápközegben, és mintegy 6 napos generációs idővel bírnak (öszszehasonlításként ez a generációs idő mintegy 24 óra a szérumfüggő Bowes-RPMI 7272 sejtvonalnál). Az összefolyásnál a sejteket átoltjuk olyan módon, hogy a lombikot erőteljesen megcsapoljuk, hogy a tapadó sejtek kimozduljanak a tápközegbe. Az ezzel a mechanikus módszerrel kimozdított sejteket RPMI-1640-ben szuszpendáljuk mintegy 106 sejt/ml koncentrációban és ezt alkalmazzuk friss szö-10 g 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
