197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
197766 A találmány vonatkozik olyan humán sejtvonalakra, amelyek képesek burjánzásra szérum vagy bármilyen exogén makromolekuláris növekedési faktor távollétében. A találmány ezen kívül eljárást nyújt az említett sejtvonalak termeléséhez. A rekombináns DNS technológia és a sejttenyésztési technikák megjelenésével az elmúlt években a hasznos és a farmakológiailag érdekes anyagok, főleg fehérjék, mint pl. interferon, inzulin és antigének szabályozott biológiai termelése lehetővé vált. Növekvő igény van olyan biológiai rendszerek kifejlesztésére, amelyek biológiailag, főleg farmakológiailag érdekes további fehérjék nagy léptékű termelését biztosítják. A fehérje kifejezés, ahogy eddig használtuk és a későbbiekben használni fogjuk, nagy molekulatömegű polipeptidekre is vonatkozik, pl. 34000-nél nagyobb tömegű polipeptidekre, valamint a kisebb molekulatömegű polipeptidekre is, pl. 34000-nél kisebb molekulatömegű polipeptidekre, valamint mindezek származékaira, pl. glikozilezett, foszfátéit és szulfátéit származékaira. A rekombináns DNS technikában történt előrehaladás lehetővé tette egy kívánt fehérjét kódoló gén bevezetését mikroorganizmusokba, majd a mikroorganizmusok indukcióját a fehérje termelésére. Több biológiailag fontos molekulát azonban nem lehet szintetizálni ezzel a technológiával. Ez különösen igaz olyan molekuláknál, amelyek szerkezete még nem ismert. Legtöbb esetben a genetikailag módosított mikroorganizmusok által kiválasztott fehérjék nem hű másolatai az autentikus molekuláknak, hanem különböznek az utóbbitól az aminosavszekvencia N és C terminálisa tekintetében. Ez a tény a rekombináns DNS technológiában alkalmazott kísérleti munkamenet következménye. Ezen kívül glikozilezett fehérjéket nem lehet előállítani mikroorganizmusok, pl. baktériumok segítségével és bizonyos mértékben élesztők segítségével sem, mivel ezekben ehhez hiányzik a celluláris mechanizmus. Több esetben sejt- és szövettenyésztési technikát lehet előnyösen erre alkalmazni. Mivel a sejttenyészetek ép organizmusból erednek, a sejttenyészetek által termelt fehérjék minden tekintetben megfelelnek a természetben előforduló fehérjéknek. A magasabbrendű szervezetek sejtjeinek, pl. emlős sejteknek tenyésztése nagy léptékben azonban nehéz probléma. Az ilyen sejtek tápanyagigénye szigorúbb, mint a legtöbb mikroorganizmusé, amelyek szaporodnak mesterséges tápközegekben is. Az eddig leírt legtöbb emlős sejt növesztő tápközegének szérumot kell magában foglalnia, amely igen drága. A szérum költsége nagy mértékben meghatározza a sejttenyésztő technika gazdaságos megvalósíthatóságát, és korlátozhatja ennek alkalmazhatóságát fehérjék termeléséhez, amelyek egyébként nem hozzáférhetők. Bizonyos sejtek tenyészthetők szé-2 1 rummentes tápközegekben, amelyek ki vannak egészítve hormonokkal és növekedési faktorokkal, ilyenek pl. a transzferrin, inzulin, epidermális-, fibroblaszt-, vagy ideg-növekedési faktor. Legtöbb esetben azonban a sejtek nem sokszorozódnak korlátlanul ezekben a szérummentes tápközegekben. Szérummentes tápközegben burjánzó sejtvonalak nagy fontosságúak lennének olyan fehérjék termeléséhez, amelyek fogékonyak a szérum vagy exogén módon hozzáadott növekedési faktorok romlására vagy fertőzésére. Ilyen fehérje pl. az elő-szöveti plazminogén aktivátor (pro-TPA). Az úgynevezett plazminogén aktivátorok jelentős tudományos vizsgálatok tárgyaivá váltak, bemutatva ezek nyilvánvaló klinikai alkalmazhatóságát vérrögök feloldásában. A vérrögök fibrinből állnak, amely oldható prekurzorából, a fibrinogénből keletkezik a trombin enzim működése alatt. Ez egyike a megbetegedés és elhalálozás fő okainak emberen, és ennek megoldását nehéz elérni mellékhatások nélkül. Az emlős plazma tartalmaz egy olyan enzimrendszert, amely képes feloldani a fibri'nt a vérrögökben. A fibrinolitikus rendszer egyik komponense olyan enzimekből, plazminogén akivátorokból áll, amelyek a plazminogén! (a plazmin inaktív proenzim formáját) átalakítja a plazmin proteolitikus enzimmé. A plazmin ezután elbontja a rögök fibrin hálóját, és oldható termékeket képez. Azokban az esetekben, ahol a test trombolitikus potenciálja nem elegendő ahhoz, hogy a véredényen belül képződött vérrögöt eltávolítsa, pl, olyan betegekben, akik tromboembóliában vagy sebészi műtét utáni komplikációkban szenvednek, nélkülözhetetlen lehet kívülről beadott trombolitikus szerek alkalmazása. A humán plazminogénnek két aktivátora van, amely kereskedelmi forgalomban rendelkezésre áll a trombolitikus terápiához: az urokináz, amelyet emberi vizeletből vagy tenyésztett vesesejtekből izolálnak, és a sztreptokináz, amely Streptococcusokbó! kinyerhető bakteriális fehérje. Mivel ezeknek az enzimeknek egyike sem rendelkezik fajlagos affinitással fibrinhez, a tromboiízis ezekkel az anyagokkal együtt jár a plazminogén szisztémás aktiválásával, amely az alvasztó fehérjék válogatás nélküli emésztését idézheti elő, és jelentősen növeli a belső vérzés (hemorrhagia) kockázatát a kezelés során. Az urokináz egy másik hátránya a nagyon rövid használati felezési ideje az emberbe való injektálást követően. Ebből az okból az urokináz igen nagy adagjai szükségesek ahhoz, hogy hatékony fibrinolízist érjünk el. A sztreptokináz az emberek számára idegen fehérje, amely semlegesítő antitestek termelését idézi elő, amelyek blokkolják ennek működését, és allergiás reakciót idéz elő, amely ártalmas és esetleg végzetes. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
