197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
197766 A plazminogén aktivátorok egy másik csoportjáról, amelyeket szöveti plazminogén aktivátornak (ezután „TPA") neveznek, ismeretes, hogy jelen vannak legtöbb emberi szövetben. A különböző szövetekből eredő TPA-k esetleg különböznek egymástól kémiai tulajdonságaikat illetően, de immunológiailag hasonlók. Ezek az urokináztól különböznek kémiai és immunológiai tulajdonságaikat illetően, nagy mértékben megnövekedett íibronolitikus tevékenységükben fibrin jelenlétében, valamint fibrinhez való nagy affinitásukban [Thorsen és munkatársai: Thromb. Diath. Haemorrh. 28, 65—74 (1972); Rijken D. C. és Collen D.: J. Bioi. Chem. 256, 7035— 7041 (1981)]. A fibrinhez való nagy affinitás miatt a TPA tevékenysége a rög környezetére korlátozódik, ezáltal jelentősen csökken a nem szabályozott vérzés veszélye. Az alábbi vázlat a plazminogén, plazmin, fibrin, és a különböző plazminogén aktivátorok kapcsolatát mutatja be. UROKINÁZ SZTREPTOKINAZ Plazminogén (inak-—-——------► Plazmin-----— tív prekurzor a (aktív enzim a vérvérben ben, amely feloldja a vérrögöket és aktiválja a pro-TPA-t) SZÖVETI PLAZMINOGÉN AKTIVÄTOR | FIBRIN---------------*-f*----------------————* ELO-SZÖVETI PLAZMINOGÉN AKTIVÄTOR Nemrégiben két olyan beteget, akik véralvadási rendellenességekben szenvedtek, kezeltek eredményeseit humán melanoma sejtvonal tenyészfolyadékából izolált TPA-val [Weimar W. és munkatársai: The Lancet, 1018—1020 (1981)]. A TPA-nak két molekuláris formája van: az aktív kétláncú forma, és az inaktív egyláncú forma (prekurzor TPA vagy pro-TPA) [Rijken D. C. és Collen D., korábban idézett munka; Rijken D. C. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 2920— 2925 (1982); és Wallin P. és munkatársai: Progr. Fibrin. 5, 16—23 (1982)]. A pro-TPA-t át lehet alakítani aktív TPA-vá fibrinnel végzett inkubálással vagy plazmin hatásával, amely ezzel a többlépcsős, vízesésszerü reakcióval beindítja saját szintézisét. A humán TPA forrásai közt találjuk a különböző emberi szöveteket (amelyek nem állnak rendelkezésre kereskedelmi felhasználásra) és különböző emberi tumorsejteket, amelyekről kimutatták, hogy különböző mértékben TPA-t bocsátanak ki [Wilson E. L. és munkatársai: Cancer Research 40, 933— 938 (1980); Wilson E. L. és munkatársai: Blood 61, 568—574 (1983)]. Egy nemrégiben benyújtott szabadalmi bejelentésben (EP 41766, feltalálók: Collen D., Rijken D. C. és Matsuo O.) egy 72000 molekulatömegű TPA-t ismertetnek, amelyet tenyésztett humán melanoma sejtvonalból (Bo-3 wes) izoláltak, és amely valószínűleg azonos a már korábban leírt TPA-val [Wilson E. L.: Cancer Research, 40, 933—938 (1980) j. Más, eddig ismert sejtvonalakhoz hasonlóan ez a Bowes humán melanoma sejtvonal szérum, pl. borjúembrió szérum jelenlétét igényli a növekedéshez. A szérum azonban nagyon drága és olyan fehérje-szerű komponenseket tartalmaz, amelyek szennyezik az így termelt TPA-t, és gátolják a nagy menynyiségü pro-TPA izolálását. Ez fárasztó és munkaigényes tisztítási eljárásokhoz vezet mind a TPA-nál, mind a pro-TPA-nál. A jelen találmány legyőzi az eddig ismert sejtvonalak hátrányait és lehetővé teszi olyan új emberi sejtvonalak előállítását, amelyek növekszenek szérum vagy bármilyen külső makromolekuláris növekedési faktor távollétében is. Az utóbbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. Szérumtól függetlenül humán sejtvonalak eiőáflítása A jelén találmány olyan új humán sejtvonalakat nyújt, amelyek növekednek szérum, vagy más exogén, makromolekuláris növekedési faktor, pl. inzulin, transzferin, epidermális növekedési faktor, stb. távollétében is. A jelen találmány szerinti sejtek képesek a tenyésztő edényhez tapadni még szérum vagy íibronektin távollétében is. Az új sejtvonalak előnyei az alábbiak. — a költségek rendkívüli csökkenései, mivel a borjúembrió szérum rendkívül drága; — az új sejtvonalak által termelt termékek nagyon olcsó és egyszerű tisztítása, mivel szérum-szennyezések nincsenek a tápközegben és a terméket könnyen lehet tisztítani szérummentes tápközegben; és — olyan fehérjék termelésének lehetősége, amelyek a szérumban levő proteázok jelenlétének következtében nem kaphatók meg (vagy csak igen szerény kitermeléssel kaphatók meg) szérum-függő sejtvonalakból. Az új, szérumtól független humán sejtvonalak előállításának művelete az alábbi lépésekből áll: a. ) a szérum-tartalmú tápközeget eltávolítjuk egy szérumfüggő humán sejtvonal tenyészetéből és szérum-mentes tápközeggel helyettesítjük; b. ) tapadó vagy nem tapadó sejteket táplálunk be szérummentes tápközeggel; és c. ) a sejteket addig hagyjuk növekedni, amíg egy szérumtól független sejtvonal kialakul. A „szérummentes tápközeg'', ahogy eddig használtuk és ezután használjuk, olyan tápközeget jelöl, amely nem csupán a szérumtól van megfosztva, hanem mindenféle makromolekuláris növekedési faktortól is. Következésképpen egy olyan sejtvonalat, amely mind szérum, mind exogén, makromolekuláris növekedési faktorok távol létében növekszik, „szérumtól független sejtvonal"-nak nevezünk. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
