197668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Ó-ketokarbonsav-hidrazinokat és -oximokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197668 Ezek a tények elkülönített máj-mitokondriimi vizsgálatával erősíthetők meg. Mint az ábrából látható, a transzportálandó szabad zsírsavak először CoASH-val aktiválódnak. Ezután következik a külső mitokondrium-membránon a CAT I katalizálta kapcsolás a karnitinhez, majd a karnitin-rész belső mitokondrium-membránján a CAT II segítségével ismét létrejövő hasítás, mely a zsírsav CoASH-val történő egyidejű aktiválása közben történik. Míg minden eddig ismert szintetikus és fiziológiás (például malonil-CoA) gátló anyag hatását a CAT I-en fejti ki, az (I) — (V) általános képletű vegyületek a CAT I hatás mellett túlnyomórészt hatást fejtenek ki a CAT II-re is. A kísérlet végrehajtása és az eredmények a következő II. kísérletből láthatók, mely kísérlet során a CAT-mérés-rendszerben acil-komponensként palmitoil-karnitint használtunk. Ezért ebben a CAT helyett a pontosabb CPT fogalmat használjuk. II. Kísérlet A CPT(CAT)-aktivítás mérése 48 órán át kópia Itatott tengeri malacok máját altatásos érzéstelenítés közben kipreparáljuk és a kötőszövet nagyobb részét eltávolítjuk. Szűrőpapíron történő rövid leitatás után a szervet azonnal 60 ml, következő összetételű preparációs közegbe helyezzük: Szacharóz (250 mM) trietanolamin HC1 (10 mM) EDTA-K (ImM) A pH értéket 20%-os kálium-hidroxid oldattal, elektromos pH-mérő segítségével 7,45 értékre állítjuk. A májat ezután ollóval kis darabokra vágjuk és kétszer-háromszor mossuk, hogy a rátapadt vérmaradékot eltávolítsuk. Ezután a májdarabokat aprítókészülék segítségével homogenizáljuk és az így nyert homogén anyagot körülbelül 20 ml végtérfogatúra alakítjuk. A mitokondrium elkülönítésére 700 g értéknél 15 percen át centrifugáljuk, a felül levő részt összegyűjtjük és további 15 percen 5 át centrifugáljuk 9000 g értéknél. A csapadékot a preparációs közegben háromszor mossuk, és minden alkalommal újból centrifugáljuk. Az így nyert egyesített mitokondri- 5 umot végül a preparációs közegben szuszpendáljuk. Ezt a mitokondrium-szuszpenziót használják minden meghatározásnál. A protein-koncentrációt biuret-módszerrel állapítjuk meg. 10 A CPT-aktivitás meghatározása Vizsgálati elv: Palmitoil-karnitin(C14) + CoASH Palmitoil-CoA + Karnitin (C14) A CAT-aktivitás meghatározása a palmi- 15 toil-karnitin-C14-ből a karnitin-C14 képződése irányában történik. A CAT II belső mitokondrium-membránon történő ismert lokalizációja és a CoASH áthatoló képességének hiánya miatt nyilvánvaló, hogy ennek a koenzim- 20 nek hozzáadása nélkül csak a CAT II tud eljutni a belső mitokondriális CoASH-pool-hoz. Ilyen körülmények között ezért érintetlen mitokondriumnál kizárólag a CAT II-t mérjük. 25 Amennyiben azonban a mitokondrium-preparációt ultrahanggal kezeljük, vagy az inkubációs közeghez CoASH-t adunk, úgy a CAT I és CAT II aktivitásának összegét határozzuk meg. 3Q Az inkubációs közeg a következő összetételű: (végkoncentráció a tesztben) 6 KC1 120 mM kh2po4 5 mM trietanol-amin x 2H20 20 mM F.DTA K2 x 2H20 0,5 mM I -maleát 0,5 mM Szacharóz 25 mM MgCI2 x 6H20 5 mM Marhaalbumin 5 mg/ m I. A következő szubsztrátumokat az anyagokát használtuk (végkoncent ráció a tesztben): CoA 0,10 mM Palmitoil-karnitin (C14) 0,10 mM Vizsgálati anyag 0,01 mM A 25 jelű vegyület és 1 -fenil-etil-biguanid 0,05 mM Kísérleti elrendezések a CPT II és CPT I aktivitás meghatározásánál /ml-ben/ Ink. ^2*^ CoASH Anyag mito- palm. - anyag kondr. kant. Vak~érték 0,5 0,5--100 % érték CPT II 0,5 0,5--0,1 O-érték 0,5 0,3--0,1 0,1 kontroll 0,5 0,3 0,1 0,1 HCIO 4 0,1 0,1 5
