197596. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197596 2. táblázat folytatása Mikroorganizmus 11 12 gátló zóna átmérője (mm) AB-kezarirodin Escherichia coli 9632 - -Pseudomonas aeruginosa - -Proteus vulgaris - -Candida albicans 20 20 Kezarirodin antitumor-hatása A citosztatikus hatékonyság meghatározása az egér L12I0 jelű leukémiasejtjein történt, az alábbi teszt-rendszerben. a) proliferációs teszt A módszerre jellemző, hogy a sejteket in vitro a kísérleti anyagok különböző koncentrációival inkubáljuk, majd meghatározzuk, hogy a sejtek milyen mértékben képesek rádióaktív DNS-prekurzorok (például C14-el jelzett timidin) beépítésére. Kezeletlen L1210-sejteket azonos kísérleti körülményeknek vetünk alá, ezek a kontrollt szolgálják. Az alábbiakban a módszert röviden leírjuk. A növekedés exponenciális fázisában (5Xl03/ml RPMI-kőzeg) lévő L1210-sejteket mikrotiter lemezen 72 órán át a kísérleti anyag különböző koncentrációval inkubálunk (37°C, 5% C02, 95% relatív páratartalom). A kontrollt képező sejteket csupán friss közeggel inkubáljuk. Minden meghatározás 4 ismétlésben készül. 65 óra elteltével 50 p C14- -timidint (1,5 pCi/ml) adunk a tenyészethez, a sejtben lévő DNS rádióaktív jelölése céljából. 7 óra inkubálás után a sejteket leszívatjuk, a DNS-t 5%-os triklórecetsavval kicsapjuk és először vízzel, majd metanollal mossuk. 50°C-on végzett szárítás után a DNS-be beépített rádióaktivitást 5 ml szcintillációs folyadék hozzáadása után meghatározzuk. Az eredményt a tesztanyaggal végzett inkubálás után mért szcintillációs indexként adjuk meg a kontroll százalékában. Az így kapott értékekből dózis-hatás-görbét rajzolunk, és grafikusan meghatározzuk az lCS0-értéket, 15 azaz azt a koncentrációt, amely a kísérleti körülmények között a rádióaktív timidin beépítését a kontrolihoz képest 50%-kal csökkenti. Az IC50-értékeket a 3. táblázatban adjuk meg 2Q (referencia: ADM = adriamicin) b) Törzssejtekkel végzett folyamatos kísérlet lágy agaron A módszerrel kimutatható, hogy van-e a tesztanyagnak befolyása a leukémiasejtek 25 több generáción keresztül figyelt növekedési viselkedésére (10—12 órás sejtciklusidő mellett a 7 napig tartó kísérlet során mintegy 14 egymást követő generáció figyelhető meg.) Citrosztatikusan hatékony anyagok a fenti tesztben a telepek számának csökkenését ered- 33 ményezik, a kezeletlen kontrolihoz viszonyítva. A tesztet az alábbiak szerint hajtjuk végre: Lemezenként 500 L1210-sejtet a megvizsgálandó anyag különböző koncentrációban 35 inkubálunk. A hatóanyag a lágy agarlemez felső rétegben van. A lemezeket termosztátban 37°C-on, 95% relatív páratartalom és 5% C02 mellett 7 napig inkubáljuk. Utána megállapítjuk a kinőtt, 60 p-nál nagyobb át- 40 mérőjű telepek számát és a kezeletlen kontroll százalékában adjuk meg. Az így kapott dózis-hatás-görbe alapján meghatározzuk az anyag hatékonyságára jellemző IC50 értékét. A kezarirodin IC50-értékét a 3. táblázatban 45 a referenciaként alkalmazott adriamicinével hasonlítjuk össze. 3« táblázat: antitumor-hatás Anyag IC5Q (jjg/ml) proliferációs törzssejtekkel végzett teszt adriamicin 6,0 x ÍO"3 2,2 X C\J 1 o pH kezarirodin A 3,1 x 10“2 3,1 X 10-2 kezarirodin B 0,1 2,8 X io"2 7
