197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33, (1985) 103—119]. Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-tryptone-t, 5 g Bacto Yeast extract-ot és 5 g NaCI-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A ß-galaktozidäz enzim N-terminimális rész (a-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként: 20 g casaminosav 6 g Na2HP04 3 g KH2P04 0,5 g NaCl 1 g NH4C1 15 g Bacto-Agar 20 mg X-gal (dimetil-formamidban oldva) 2 mM MgCl2 0,1 mM CaCl2 A ß-laktamäz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 pg/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törzset 100 pg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és OD600„m 0,7—0,8 elérésekor 170 pg/ml kloramfenikolt adunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS izolálásákor a Clewell és Helinski által leírt módszerrel tiszta lizátumot készítettünk [Clewell, D.B. and Helinski, D.R., (1969) SupCrcoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1159—1166], majd a plazmid DNS-t Sephacryl S1000 (Pharmacia) oszlopon vagy cézium-klorid-etidium-bromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálásra (1,0—1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowicz által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England Biolabs által javasolt reakciókörülmények között történt. Egyesszálú végeket tartalmazó DNS fragmentumok tompa- végűvé alakítására a restrikciós enzimmel végzett hasítás után a DNS-t alkohollal kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2 1 mM ditiotreitol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 TTP összetételű pufferben [végtérfogat 10—20 pl, DNS koncentráció 200—250 pg/ml] oldottuk és 1—2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal 15 percet, 37°C-on inkubáltuk. Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30—40 pl) 15 0,5—1,0 pg DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7,6), 5 mM MgCI2-ot, 5 mM ditiotreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység f4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2—3 órán át, 14°C-on végeztük [Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30—40 pg/ml DNS, 25 mM Tris-WC.l pH 7,4 5 mM MgCL, 5 mM ditiotreitol, 0,25 mM spermidin, 1 mM ATP, 10 pg/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakcióelegyhez 4—6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8—12 órán át 14°C-on inkubáltuk DNS minták gélelektroforézisét 0,8 — 2,0 %-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mtsai által leírt (1974) módon végeztük. A poliakrilamid gélelektroforézis — 4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva — a Maniatis, T., Jeffrey, A and van de Sande, H. (1975) [Chain length determination of small double and single-stranded DNS molecular by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry 14, 3787— 3794] által közölt recept szerint történt. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Winberg G., Hammarskjöld, M. (1980) [Isolation of DNA from agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253] DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk. BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 100 pg/pl végkoncentrációban, 600 mM NaCl, 12 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30°C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 pg DNS-hez 0,4—1,2 egység enzimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátummal teszt reakciót készítettünk, amelyben különböző idejű inkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottuk le, és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3’ végek jelölésére alkalmas reakciókörülmények között Klenow polimerázzal tompa végekre javítottuk [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. Kompetens sejteket a HB10I, C600 IM101 és ED8800 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Lab., New York] CaCl2-os eljárással készítettünk. DNS fragmentumok 5’ végeinek defoszforizálása, végjelölése polinukleotid kinázzal és ~32P ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilbert, W. (1980) [Sequencing end-labeled DNA with 16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
