197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 basespecific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65 449—560] által leírt protokol szerint történt. Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Mpniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] által leírt útmutatásokat követtük. Ábra ismertetés 1. ábra A pBB9' plazmid szerkezete A pBR322 vektor eredetű részt kettős vonal; a Mifd18 DNS-ből származó részt vastag vonal jelzi. A körön belül feltüntettük a legfontosabb géneket, illetve szabályozó régiókat. A nyilak a restrikciós endonukleázok hasítási helyeit jelzik. Jelölések: amp' az ampicil 1 in rezisztenciát biztosító ßlaktamáz gén; tetr tetraciklin rezisztencia gén (a BamHl helyre inszertált DNS miatt a tetraciklin rezisztencia gén inaktiválódott); X a lambda eredetű rész a Xrifd18 transzdukáló tágból származó fragmentumon; 16S1 23S, az rrnB operon érett riboszomális RNS- 5SJ nek megfelelő részei; P,, 2 az rrnB operon promoterei; T,, 2 az rrnB operon terminátorai; P: Pstl; E: EcoRI; H: HindlII; B: BamHl; S: Sail; Hp: Hpal; Pv: Pvull; F: FsplI. 2. ábra: A pBB9A9 plazmid szerkezete Bevonalazottan jelöltük azt a részt, amelyet a pBB9 plazmidból a BAL31 nukleázzal képzett delécióval eltávolítottunk. A jelölések megegyeznek az I. ábrán leírtakkal. 3. ábra A pERVl/23 plazmid különböző eredetű részei összekapcsolódásainak nukleotid szekvenciája. 4. ábra: A pBB9-b28 plazmid szerkezete. A jelölések megegyeznek az 1. és 2. ábrán használtakkal. A vastag, vonalazott részek a pBB9 plazmidból két lépésben eltávolított régiókat jelölik. 5. ábra: A p408—5 plazmid szerkezete. A jelölések megegyeznek az eddigiekben használtakkal. 6 6. ábra: Az rrnB és lac operonok részeinek összeépítése a pER plazmidokban. 17 A pER plazmidok kialakításának egyes lépéseit a p419—-10 jelzésű plazmidból és a pLBU3 plazmid EcoRI-HindlII „B“ fragmentumából részletesen felrajzoltuk. A jelölések: ApR : ampicillin rezisztencia gén; Ro: replikációs origó; T, és T2: az rrnB operon terminátorai; P2: az rrnB operon promotere; 16S és 5S: az rrnB operon megmaradt részei. A kimetszett részek a deléciók helyét jelölik. A jobb felső ábra a pER plazmidcsaládot ábrázolja, melyek tagjai csak a BAL31 nukleázzal eltávolított szakasz nagyságában térnek el egymástól. (A jel körüli egymásba ágyazott „kapuk“ a különféle deléciókat jelölik.) 7. ábra: A pERVI/23 és a pERVI/23 [ Nsi] plazmidok promoterének szekvenciája. Az rrnB és lac operon eredetű részek kapcsolódása az a.) pER V1/23 és a b.) pER VI/23[-Nsi] plazmidban. Jelzések: .... AT-gazdag pre promoter régió az rrnB P2 promoter előtt------ a 6/23 promoter rrnB eredetű —35-ös régiója — a 6/23 promoter rrnB eredetű — 10-es régiója xx a transzkripció iniciáció helye a lac eredetű riboszóma kötőhely A Courier betűvel írt szekvencia az rrnB, a dőlt betűvel írt a lac operon eredetű részt jelöli. A lac operátort és az a-peptid első aminosavait megjelöltük a szekvenciában. 8. ábra: A jtVX eredetű HindlII-HindlII polilinker szekvenciája a PLH4-nek megfelelő orientációban. 9. és 10. ábra: Az expressziós vektorcsalád sematikus ábrázolása. A gyűrű alakú molekulán jelöltük az ampicillin rezisztencia gént (ApR), a replikációs origót (ŐRI), a 6/23 [-Nsi] promotert (p), a lac operátor szekvenciát (OP). a riboszóma kötőhelyet (SD) és a két terminátor régiót (T,, T2). A hullámos vonallal jelzett, az egyes plazmidokra jellemző régió és környezete részletesebb rajzain az előbbi rövidítések mellett feltüntettük a ß-galaktozidázt kódoló részeket (a), klóramfenikol-acetil-transzferázt kódoló részeket (CAT) és a klónozáshoz használható restrikciós endonukleázok hasítási helyeit (Pvull, HindlII, Clal, EcoRI, BamHl, Pstl, BglII, Xbal, Hpal) is. A zárójelbe tett (EcoRV/PvuII) az összeépítés előtt létező, de az összeépítéssel eltűnő helyeket jelöli. A vektorok nevénél hely hiányában nem tüntettük fel a [-Nsi] jelzést. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
