197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 egyedi HindlII helyről kiindulva, BAL31-el deléciókat képeztünk. Az eredményül kapott plazmid az a-peptidhez fuzionált formában expresszálja a CAT-gént, egy bifunkcionális fehérjeként (ß-galaktozidäz alfa-komplementáció-kloramfenikol-acetil transzfer). Megfelelő körülmények között elérhető, hogy ez a fehérje a baktérium összes fehérjéinek 80 százalékát alkossa. (Mindkét előbb felsorolt plazmid az indukció fokától függő mértékű kloramfenikol rezisztenciát biztosít a gazdasejteknek). 3. A másik prokariota eredetű gén a Bacillus sphericus modifikációs metiláz-génje volt (BspRI modifikációs metiláz), melyet expressziós vektorunkkal túltermeltettünk. Annak ellenére, hogy a metiláz-gén terméke erősen zavarja az E.coli életműködését (DNS- kötő és metiláló fehérje) elérhető, hogy az összfehérje 2—4 százaléka a metiláz-enzim legyen. 4. Eukariota gén expresszálására példaként a humán proinzulint kódoló gént ültettük be a pmed/23 plazmid Clal-EcoRI helyére. Humán inzulinómából az MTA Szegedi Biológiai Központjának Biokémiai Intézetében Dr. Venetianer Pál és munkatársai készítettek egy cDNS kiónt, melyből a humán proinzulin-gén izolálható volt. A cDNS kiónt Clal, illetve EcoRI linkerekkel kapcsoltuk pmed/23 plazmid Clal, EcoRI helyére úgy, hogy a Clal linker után a humán proinzulin első kodon ja, — egyelőre nem helyes leolvasási fázisban — következett. Clal emésztés, a ragadós vég feltöltése majd ligálás után, helyreállt a leolvasási fázis, úgy, hogy- a Clal linker eredetű ATG kódolta metionin aminosav lesz a fúziós fehérjében közvetlenül a proinzulin előtt. így a fúziós fehérjéből a proinzulin kémiai módszerekkel kihasítható. A kapott plazmid [pmed/231nz] megfelelő körülmények között a baktérium összfehé/je 25—40 százalékát kitevő mértékben termeli túl a proinzulin fúziós fehérjét. 5. példa Az eddigiekben a vektorcsalád fúziós tagjainak különböző alkalmazási lehetőségeire láthattunk példákat. Említettük azonban, hogy rendelkezünk olyan vektorokkal is, amelyek lehetőséget biztosítanak fehérjék önálló kifejeztetésére. Ezen vektoroknak is megtörtént a gyakorlati kipróbálása. A pER-VI/23 [+ATG] elnevezésű plazmidba a Clal, EcoRI helyre beklónoztuk a TNF (tumor nekrózis faktor), 5’ végén Clal linkerrel ellátott génjét. így a transzláció a vektor konstruálásánál leírtaknak megfelelően a Clal linker ATG szekvenciájáról indul. A biológiailag aktív TNF mennyisége indukció után a sejt összes fehérjének mintegy 10—15%-át teszi ki. A példában a következő anyagokat és módszereket használtuk, melyeket a jobb áttekinthetőség kedvéért adunk meg külön. 13 8 Vegyszerek és preparátumok Az általánosan használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak. A [~32P ATP és of32P]dATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100—150 TBq/mM volt. * A használt BamHI, Hpal, Sáli, PvuII, EcoRI, Bsl, HindlII, PstI, BglII, Xbal, FspII restrikciós endonukleázokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján [Methods in Enzimology (Ed: L. Grossmann, V. Moldave) 65, 89—180}. A Clal, Stul, Hhal enzimek a New England Biolabs készítményei voltak. A BAL31 nukleáz és Klenow-enzim (E.coli DNAP-polimerasel Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) Worthington, a pankreász RN- áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt. A T4 indukált polinukleotid ligáz Murray et al. módszere szerint készült [Murray, N. E., Bruce S. A. and Murray, K: Molecular cloning of the DNA ligase gene from bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 132, (1979) 493—505). Törzsek Escherichia coli HB101 [pro, leu, thi, lac, strR, r, m, endol, recA: Boyer, H.W. Roulland-Dussoix, D. (1969) A complementation analysis of the restricton and modification of DNA in E.coli J.Mol.Biol. 41, 459—472] (MNG 00290). Escherichia coli ED8800 [SupE, SupF, hsdS, met, lacZM15, recA56: Murray, N.E. B-ammar, W.-J. and Murray K. (1977) Lamboid phages that simplify the recovery of in vitro recombinants. Moi. gen. Genet. 150, 53—61], (MNG 00291). rifd 18 [Kirschbaum, J.B. and Konrad, E.B. (1973) Isolation of a specialized lambda transducing bacteriophage carrying the beta subunit gene for Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. J. Bacteriol. 116, 517—526] pBR322 [Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Green, P.J., Betlach, M., Heyneker, H. L.. Boyer, H.W., Crosa, J. and Falkow, S. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. Gene 2, 95—113], (MNG 00298). pLBU3 [Gentz, R., Langer, A., Chang, A.C.Y., Cohen, S.N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream placement of a RNA termination signal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4936^40]. pHC314 [Boros, I., Posfai, Gy. Venetianer, P. (1984) Eljárás nagy kópiaszámú plazmid vektorok előállítására, T/35280 közzétételi számú magyar szabadalmi bejelentés], (MNG 00980). E.coli K12 JM107 [Yanisch-Perron, C. és mtsai: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
